余漢忠,李磊,董勃,孔倩倩,鈕威,張凱,魏書瑤,方路,王麗(.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市立醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇徐州 6;.徐州市腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇徐州 005)

原發(fā)性高血壓(EH)被認(rèn)為是環(huán)境和遺傳因素相互作用的結(jié)果,約30%的個(gè)體間血壓變異性由遺傳因素決定[1]。EH是心血管疾病、中風(fēng)和腎臟等疾病最常見的危險(xiǎn)因素[2-3]。腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在血壓調(diào)節(jié)中具有重要作用,并且與EH發(fā)病密切相關(guān)[4]。血管緊張素Ⅱ受體是RAAS重要的成員之一,主要分為以下2種類型:1型(AGTR1)受體和2型(AGTR2)受體。AGTR1基因由位于染色體3q上的5個(gè)外顯子組成,其中前4個(gè)外顯基因編碼5′-非翻譯區(qū)(5′-UTR),最后1個(gè)外顯基因編碼3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)的多態(tài)性,導(dǎo)致腺嘌呤(A)在1 166位的堿基轉(zhuǎn)換為胞嘧啶(C)[5]。AGTR1(A1166C)基因多態(tài)性(SNP ID:rs5186)在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮血管收縮、平滑肌細(xì)胞生長和細(xì)胞肥大等重要作用,受主要信號(hào)機(jī)制調(diào)控,并參與調(diào)控EH患者的血壓水平。筆者通過分析徐州地區(qū)AGTR1基因多態(tài)性與EH的關(guān)系,探討AGTR1(A1166C)基因多態(tài)性與EH患者臨床檢驗(yàn)指標(biāo)水平的關(guān)聯(lián),以期為EH的個(gè)性化診療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1一般資料 選取2022年1月至12月徐州市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科確診的240例EH患者(EH組)作為研究對(duì)象,男145例,女95例,年齡(53.2±13.4)歲。均根據(jù)中國高血壓防治指南(2018 年修訂版)[6]診斷為EH。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg;(2)首次診斷后2個(gè)月內(nèi)3次偶測血壓值均符合上述標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)具備以上2條即可納入病例組,且患者未服用任何抗高血壓藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):繼發(fā)性高血壓患者,患嚴(yán)重的肝腎疾病,血液系統(tǒng)疾病,惡性腫瘤,自身免疫性疾病以及近期有手術(shù)、外傷和嚴(yán)重感染者。另選取同期本院體檢健康者180例作為健康人對(duì)照組,男95例,女85例,年齡(52.23±8.87)歲。本研究獲徐州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.xyyll-2021-098),各研究對(duì)象知情同意。

1.2儀器與試劑 CFX96型核酸擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司),AU5821全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司),cobas E801化學(xué)發(fā)光分析儀(德國羅氏公司),Snibe MAGluMI X8化學(xué)發(fā)光分析儀(深圳新產(chǎn)業(yè)公司)。血液基因組提取試劑盒、AGTR1(A1166C)基因檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自武漢友芝友醫(yī)療科技公司,腎素活性(PRA)、血管緊張素2(AT2)、醛固酮(ALD)測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)購自深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份公司,TSH、FT3、FT4測定試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)購自德國羅氏公司,TC(酶法)、AST(MDH法)、ALT(乳酸脫氫酶法)、T-Bil(重氮鹽法)、D-Bil(重氮鹽法)、TBA(酶循環(huán)法)、Ure(尿素酶-谷氨酸脫氫酶法)檢測試劑盒購自江蘇貝克曼庫爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)公司,TG(終點(diǎn)法)、HDL-C(終點(diǎn)法)、LDL-C(終點(diǎn)法)、apo A1(透射比濁法)、apo B(比濁法)、Lp(a)(乳膠增強(qiáng)免疫比濁法)、apo E(免疫比濁法)、ALP(NPP底物-AMP緩沖液法)、GGT(速率法)、UA(尿酸酶-過氧化物酶法)、Glu(己糖激酶法)購自南京東軟威特曼生物科技公司,NEFA(酶法)購自上海?？瞪锟萍脊?sdLDL-C(過氧化物酶法)購自北京安圖生物工程公司,ADA(過氧化物酶法)、AFU(CNPF底物法)購自北京利德曼生化股份公司,CG(均相酶免疫法)購自蘇州博源醫(yī)療科技公司,Cr(肌氨酸氧化酶法)、CysC(乳膠增強(qiáng)免疫比濁法)、FMN(四氮唑藍(lán)法)、IMA(清蛋白有限鈷結(jié)合法)、Hcy(酶循環(huán)法)購自寧波瑞源生物科技公司。

1.3標(biāo)本采集 使用促凝管采集EH患者住院第1天和體檢健康者體檢時(shí)晨起空腹(禁食8～12 h)靜脈血5 mL,4 000 r/min離心5 min,分離血清,檢測生化、甲狀腺相關(guān)指標(biāo),另取EDTA-K2抗凝血5 mL檢測PRA、AT2指標(biāo),取肝素抗凝血5 mL檢測ALD含量。血清樣本置于-20 ℃保存。

1.4血液基因組DNA提取 按照血液組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取,蛋白質(zhì)核酸分析儀檢測DNA的濃度及純度,選取吸光度比值(A260 nm/A280 nm)在1.6～2.1,濃度0.5～50 ng/μL之間的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。DNA樣本置于-20 ℃保存。

1.5引物設(shè)計(jì)及AGTR1(A1166C)基因多態(tài)性檢測AGTR11166 A-C引物與探針由武漢友芝友醫(yī)療科技公司設(shè)計(jì)并合成,其上游引物序列(AGTR1-F):5′-CATTCCTCTGCAGCACTTCAC-3′,下游引物序列(AGTR1-R):5′-AGAAAAGTCGGTTCAGTCCAC-3′。PCR總反應(yīng)體系為25 μL,包括5×buffer 5 μL、MgCl2(1 mol/L) 0.125 μL、dATP(100 mmol/L) 0.037 5 μL、dCTP(100 mmol/L) 0.037 5 μL、dGTP(100 mmol/L) 0.037 5 μL、dUTP(100 mmol/L) 0.075 μL、AGTR1-F(100 μmol/L) 0.05 μL、AGTR1-R(100 μmol/L) 0.05 μL、AGTR1-WP(100 μmol/L) 0.13 μL、AGTR1-MP(100 μmol/L) 0.065 μL、ICON-F1(100 μmol/L) 0.015 μL、ICON-R1(100 μmol/L) 0.015 μL、ICON-ROX-P1(100 μmol/L) 0.012 μL、DMSO 0.5 μL、BSA(100 mg/mL) 0.05 μL、50%甘油(加入反應(yīng)體系后的終濃度為4%) 2 μL、TaKaRa Taq Hot Start酶 0.1 μL、UNG酶 0.05 μL、ddH2O 14 .650 5 μL、DNA模板2 μL。PCR循環(huán)參數(shù):37 ℃ UNG處理10 min;95 ℃ 預(yù)變性5 min,95 ℃ 變性15 s,60 ℃退火及延伸1 min,共40個(gè)循環(huán)。于每個(gè)循環(huán)的延伸階段各采集1次熒光信號(hào),用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件進(jìn)行分析。每個(gè)樣本檢測3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn):FAM通道Ct值≤36且VIC通道Ct值>36或無Ct值,判定為AGTR1基因A/A型;FAM通道Ct值≤36且VIC通道Ct值≤36,判定為AGTR1基因A/C型;FAM通道Ct值>36或無Ct值且VIC通道Ct值≤36,判定為AGTR1基因C/C型。

1.6臨床檢驗(yàn)指標(biāo)檢測

1.6.1生化指標(biāo)檢測 按照貝克曼AU5821全自動(dòng)生化分析儀及相應(yīng)試劑盒說明書檢測EH患者AST、ALT、T-Bil、D-Bil、TBA、Ure、TC、TG、HDL-C、LDL-C、apo A1、apo B、apo E、Lp(a)、 ALP、GGT、UA、Glu、NEFA、sdLDL-C、ADA、AFU、CG、Cr、CysC、FMN、IMA、Hcy等生化指標(biāo)。各指標(biāo)的參考區(qū)間:AST 0～50 U/L、ALT 0～50 U/L、T-Bil 5～21 μmol/L、D-Bil 0～3.40 μmol/L、TBA 0～13 μmol/L、Ure 2.80～7.60 mmol/L、TC 3.00～5.70 mmol/L、TG 0.34～1.70 mmol/L、HDL-C 1.04～1.67 mmol/L、LDL-C0～3.12 mmol/L、apo A1 1.00～1.60 g/L、apo B 0.60～1.10 g/L、Lp(a) 0～300 mg/L、apo E 2.90～5.30 mg/L、ALP 30～120 U/L、GGT 8～57 U/L、UA 154.70～428.40 μmol/L、Glu 4.30～5.90 mmol/L、NEFA 0.10～0.60 mmol/L、sdLDL-C 0.26～1.36 mmol/L、ADA 4～18 U/L、AFU 14.30～39.90 U/L、CG 0～2.70 mg/L、Cr 35～97 μmol/L、CysC 0～1.16 mg/L、FMN 1.70～2.50 mmol/L、IMA 0～78 U/mL、Hcy 4.00～15.40 μmol/L。

1.6.2RAAS及甲狀腺功能指標(biāo)檢測 按照Snibe MAGluMI X8化學(xué)發(fā)光分析儀及相應(yīng)試劑盒說明書檢測EH患者PRA、AT2、ALD水平;應(yīng)用羅氏cobas E801化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑盒說明書進(jìn)行TSH、FT3、FT4測定。各指標(biāo)的參考區(qū)間:PRA 0.10～6.56 ng/mL.h、AT2 50～120 pg/mL、ALD 70～300 pg/mL、TSH 0.27～4.20 μIU/mL、FT3 3.10～6.80 pmol/L、FT4 12～22 pmol/L。

2 結(jié)果

2.1各研究對(duì)象一般資料比較 EH患者和體檢健康者在性別、年齡、身高、體重指數(shù)等組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),EH組收縮壓和舒張壓均高于健康人對(duì)照組(P<0.05),見表1。

表1 EH患者和健康人對(duì)照組一般資料比較

2.2PCR-熒光探針法檢測AGTR1(A1166C)基因型AGTR1(A1166C)基因純合野生型A/A、雜合型A/C、純合突變型C/C的基因檢測結(jié)果見圖1。AGTR1(A1166C)基因型及基因位點(diǎn)頻率分布:EH組AA型199例,AC型36例,CC型5例;健康人對(duì)照組AA型165例,AC型15例,無CC型檢出。EH組等位基因A頻率為90.42%,等位基因C頻率為9.58%,健康人對(duì)照組等位基因A頻率為95.83%,等位基因C頻率為4.17%,2組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.815,P<0.05),提示具有AC/CC基因型的個(gè)體更易罹患EH。

注:A,AA基因型(純合野生);B,AC基因型(雜合突變);C,CC基因型(純合突變)。圖1 AGTR1(A1166C)基因檢測結(jié)果

2.3各臨床檢驗(yàn)指標(biāo)在2組中的比較結(jié)果 EH患者AC/CC組PRA、ALD、Lp(a)項(xiàng)目均高于AA組[PRA:Z=2.216,P=0.029;ALD:t=2.406,P=0.017;Lp(a):t=2.406,P=0.021];其余檢驗(yàn)項(xiàng)目在2組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2、表3。

表2 EH患者AGTR1(A1166C)基因?qū)AAS及甲狀腺功能指標(biāo)的影響

3 討論

EH是我國最常見的慢性疾病之一,嚴(yán)重危害國人生命健康,其發(fā)病與遺傳變異、環(huán)境和其他因素的相互作用有關(guān)。AGTR1基因A1166C多態(tài)性與EH之間的關(guān)系仍存在爭議,AGTR1與EH檢驗(yàn)指標(biāo)關(guān)聯(lián)的研究更是鮮有報(bào)道。因此,筆者認(rèn)為有必要進(jìn)一步揭示AGTR1A1166C多態(tài)性與EH發(fā)生、發(fā)展的關(guān)聯(lián)。

目前已有大量研究探討了AGTR1基因多態(tài)性在EH復(fù)雜病因中的作用。例如Deepak等[7]報(bào)告AGTR1C基因變異賦予EH 1.74倍的風(fēng)險(xiǎn),可能作為影響家庭高血壓易感性的預(yù)測標(biāo)志物。Chen等[8]的研究結(jié)果顯示AGTR1A1166C基因多態(tài)性在正常對(duì)照組和高血壓患者之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性。羅潔等[9]研究了湖南漢族患者以及孫曉燕等[10]研究了河南漢族人群,均證實(shí)攜帶AGTR1C型基因的人群患高血壓的危險(xiǎn)性增加。因此,筆者選擇測定EH患者AGTR1基因A1166C多態(tài)性的基因型頻率,以評(píng)估該多態(tài)性變異對(duì)高血壓發(fā)生、發(fā)展的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGTR1(A1166C)基因型及基因位點(diǎn)頻率分布在2組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明徐州地區(qū)具有AC/CC基因型的個(gè)體更易患EH,與上述研究者的結(jié)果相一致。

本研究還探討了徐州地區(qū)人群AGTR1多態(tài)性對(duì)常規(guī)檢驗(yàn)指標(biāo)的影響,并通過大量的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,以期揭示AGTR1(A1166C)基因多態(tài)性與臨床檢驗(yàn)指標(biāo)水平的關(guān)聯(lián)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EH患者AC/CC組PRA、ALD水平均高于AA組(PRA:Z=2.216,P=0.029;ALD:t=2.406,P=0.017),提示AGTR11166 C基因突變可能上調(diào)了EH患者PRA、ALD水平。RAAS與多種心血管疾病的發(fā)生有關(guān),AGTR1基因是RAS系統(tǒng)的關(guān)鍵基因,與高血壓的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示EH患者AGTR11166 C基因突變存在對(duì)血脂代謝的影響,EH患者AC/CC組Lp(a)高于AA組(t=2.406,P=0.021),表明AGTR11166 C基因突變同時(shí)上調(diào)了血清Lp(a)水平。血脂代謝在高血壓的進(jìn)展中發(fā)揮著巨大的作用,其中Lp(a)主要在肝細(xì)胞內(nèi)合成,與動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成有著密切的相關(guān)性。另有研究發(fā)現(xiàn),高心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的EH患者血清Lp(a)顆粒濃度、質(zhì)量濃度高于低風(fēng)險(xiǎn)患者[12]。本研究表明,AGTR11166 C基因突變可能通過調(diào)節(jié)PRA、ALD水平參與了高血壓的進(jìn)展,或可能通過調(diào)節(jié)Lp(a)水平參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。已有研究提示AGTR1A1166 C多態(tài)性與纈沙坦等抗降壓藥物的降壓效果顯著相關(guān),AGTR1C等位基因在纈沙坦的治療下能夠更好地控制高血壓[13-14]。而攜帶C基因的高血壓患者血清PRA、ALD、Lp(a)含量明顯高于非攜帶者,這提示臨床醫(yī)師在高血壓的診療過程中,PRA、ALD及Lp(a)含量偏高的患者有必要優(yōu)先選擇纈沙坦等血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑進(jìn)行治療。筆者同時(shí)對(duì)EH患者的其他檢驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行匯總分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGTR11166 C基因突變對(duì)AT2、TSH、FT3、FT4、TC、AST、ALT、T-Bil、D-Bil、TBA、Ure、TG、HDL-C、LDL-C、apo A1、apo B、apo E、ALP、GGT、UA、Glu、NEFA、sdLDL-C、ADA、AFU、CG、Cr、CysC、FMN、IMA、Hcy均無明顯影響。

綜上所述,AGTR1(A1166C)基因多態(tài)性在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生理作用,AGTR1基因多態(tài)性能夠?qū)H的發(fā)生、發(fā)展起到調(diào)節(jié)作用。但由于 EH 發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,一些潛在的混雜因素可能尚未完全概括,如飲食習(xí)慣、日常鍛煉、吸煙和飲酒等。若要進(jìn)一步確定AGTR1基因多態(tài)性對(duì)EH的影響機(jī)制,尚需更為深入的臨床研究,如擴(kuò)大檢測樣本量,基因聯(lián)合分析,觀察受試者用藥前后血壓和檢驗(yàn)指標(biāo)的變化等,才能得到更為全面的結(jié)果。