臧 蕾,劉明雨,邢揚帆,李 振

(臨沂大學 醫(yī)學院,山東 臨沂 276000)

金黃色葡萄球菌(SA)是臨床上常見的致病菌,廣泛存在于自然界中,是醫(yī)院和社區(qū)感染致病的重要病原菌[1],隨著抗菌藥物的廣泛使用,致使耐藥菌菌株數(shù)量漸增。而化學合成藥物研發(fā)難度大,時間長,毒副作用明顯,故從中草藥中獲取抗菌物質(zhì)、提高機體抗病力成為研究熱點。

烏梅是薔薇科植物梅的用藥部分[2],研究發(fā)現(xiàn)其含有有機酸、萜類、脂類、黃酮[2]等多種有效成分,具有抑菌[3]、抗炎、抗氧化、增強免疫和降血糖等作用[4]。探討烏梅水提取物對金黃色葡萄球菌的抗菌活性及作用機制,可為其開發(fā)及臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

高速中藥粉碎機(浙江哈瑞工貿(mào)有限公司生產(chǎn))、分光光度計(上海元析儀器有限公司生產(chǎn))、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海貝茵生物科技有限公司生產(chǎn))、臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司有限公司生產(chǎn))、電子天平(沈陽龍騰電子有限公司生產(chǎn))、高壓滅菌鍋(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))、電熱套(常州潤華電器有限公司生產(chǎn))、SW-CJ-1D 超凈工作臺(蘇州精華設備總廠生產(chǎn))、生化培養(yǎng)箱(常州欣耀宇儀器制造有限公司生產(chǎn))、酶標儀(濟南好來寶醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))、超純水機(杭州億捷科技有限公司生產(chǎn))、電熱恒溫鼓風干燥箱(鶴壁市冶金機械設備有限公司生產(chǎn))。

1.2 藥物與試劑

烏梅(山東老百姓大藥房提供)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基及營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(青島高科學海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))、堿性磷酸酶(ATP)試劑盒與乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒及蛋白定量測定試劑盒(上海嘉楚生物工程有限公司生產(chǎn))、磷酸氫二鈉與氯化鉀(天津市鑫鉑特化工有限公司生產(chǎn))。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌(中國藥品檢驗研究院生產(chǎn))。

1.4 方法

1.4.1 烏梅提取物的制備

取20 g烏梅粉置于500 mL燒瓶,加入200 mL蒸餾水,浸泡0.5 h,煮沸回流1.5 h,過濾,制得提取液。濾渣,再加蒸餾水100 mL,再次煮沸回流45 min并過濾,合并提取液,濃縮,4 ℃保存,備用[5]。

1.4.2 藥敏試驗

采用管碟法,取融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基適量,置培養(yǎng)皿中靜置3～5 min,凝固后每個培養(yǎng)皿中加入107CFU/mL的SA菌懸液適量,用L型玻璃棒涂抹均勻,放置于5個牛津杯。將不同濃度烏梅提取液(50、25、12.5 mg/mL)、青霉素(陽性對照)、生理鹽水(陰性對照)按250 μL/個加入牛津杯,放置在生化培養(yǎng)箱中,37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h,測量抑菌圈直徑(IZD,mm),進行結(jié)果判定。IZD≥20 mm,極度敏感;15≤IZD<20 mm,高度敏感;10≤IZD<15 mm,中度敏感;5≤IZD<10 mm,輕度敏感;IZD<5 mm,不敏感[6]。

1.4.3 最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定

利用試管二倍稀釋法,取9支干燥無菌試管,各加入1 mL含107CFU/mL的SA菌懸液。第1管加入0.4 g/mL的烏梅提取液1 mL,混勻,吸出1 mL加至第2管中,順次操作至第7管,混勻,吸取1 mL棄去。第8管加入青霉素1 mL,為陽性對照管。第9管加入生理鹽水1 mL,為陰性對照管。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)16～24 h,以無SA生長的試管所在的藥物濃度認定為最小抑菌濃度(MIC)。將未見細菌生長的試管搖勻,分別吸取100 μL加入到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,置生化培養(yǎng)箱內(nèi),37 ℃培養(yǎng)18～24 h,觀察細菌生長狀況,計算平板上的SA菌落,以活菌計數(shù)法表示平均菌落數(shù),<5個對應的最小稀釋度的提取物質(zhì)量濃度即最小殺菌濃度(MBC)[6-7]。

1.4.4 烏梅水提取物抑菌機制研究

1)烏梅水提取物對金黃色葡萄球菌堿性磷酸酶的影響[8]。準備LB液體培養(yǎng)基,分別加入烏梅水提取物,使其濃度分別為MIC和2MIC。以不含烏梅水提取物的培養(yǎng)基作為對照,分別加入SA菌懸液,37 ℃、150 r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng),于0、2、4、6、8 h時吸取菌液,3 500 r/min離心10 min,取上清液,用試劑盒測定AKP活性。

2)烏梅水提取物對金黃色葡萄球菌乳酸脫氫酶活性的影響[9]。分別于0、2、4、6、8 h時取實驗組與對照組SA菌懸液,3 500 r/min離心5 min,取上清液,用試劑盒測定胞外LDH活性。

3)烏梅提取物對金黃色葡萄球菌胞外蛋白的影響。分別于0、2、4、6、8 h時取試驗組與對照組SA菌懸液,3 500 r/min離心5 min,取上清液,加入考馬斯亮藍染色劑,靜置5 min,用酶標儀測定595 nm波長處吸光度。

2 實驗結(jié)果

2.1 烏梅水提取物抑菌效果

2.1.1 藥敏試驗

從表1可知,烏梅水提取物可明顯抑制SA。濃度分別為12.5、25、50 mg/mL時,抑菌圈直徑分別為17.50±0.94、20.11±1.03、22.82±0.88 mm,陽性對照,抑菌圈直徑為15.34±1.26 mm,陰性對照,無抑菌現(xiàn)象,說明金黃色葡萄球菌對烏梅水提取物高度敏感。

表1 烏梅水提取物抑菌直徑Tab.1 Bacteriostatic diameter of plum extract

2.1.2 對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

MIC和MBC能夠直觀反映抑制細菌生長的最低濃度。由表2可知,烏梅提取物對SA的MIC和MBC分別為6.25 mg/mL、12.5 mg/mL,陰性對照組菌體生長良好。

表2 烏梅提取物對SA的MIC、MBC測定結(jié)果Tab.2 Determination results of MIC and MBC of plum extract against Staphylococcus aureus

2.2 烏梅水提取物抑菌作用機制

2.2.1 對金黃色葡萄球菌堿性磷酸酶的影響

烏梅水提取物對SA堿性磷酸酶(AKP)的影響結(jié)果見圖1。隨著處理時間的增加,經(jīng)過MIC和2MIC烏梅水提取物處理后,菌懸液中AKP含量持續(xù)升高,在6 h后趨于平穩(wěn)。2MIC烏梅提取物處理的SA菌懸液AKP含量超過MIC,表明烏梅水提取物可破壞SA細胞壁,從而使AKP含量增加[10]。

圖1 烏梅水提取物對SA堿性磷酸酶的影響Fig.1 Effect of plum extract on alkaline phosphatase of Staphylococcus aureus

2.2.2 對金黃色葡萄球菌乳酸脫氫酶的影響

烏梅水提取物對SA乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響結(jié)果見圖2。隨著處理時間的增長,烏梅水提物處理菌液中LDH活性不斷增強,2 MIC組烏梅提取物處理的SA菌懸液LDH活性高于MIC組,說明烏梅提取物的處理使SA細胞膜通透性增加,導致LDH含量增加。

圖2 烏梅提取物對SA乳酸脫氫酶的影響Fig.2 Effect of plum extract on lactic dehydrogenase of Staphylococcus aureus

2.2.3 對金黃色葡萄球菌胞外蛋白的影響

烏梅水提取物對SA胞外蛋白的影響如3圖所示。隨著處理時間的增加,胞外蛋白濃度逐漸增加,其中2MIC烏梅水提取物處理的SA菌懸液胞外蛋白含量高于MIC,表明烏梅水提取物可增加SA的細胞膜通透性,造成細菌蛋白質(zhì)外泄,從而引起菌體胞外蛋白含量的增加。

圖3 烏梅水提取物對SA胞外蛋白的影響Fig.3 Effect of plum extract on extracellular protein of Staphylococcus aureus

3 討論

通過宿主細胞內(nèi)的支撐和保護,金黃色葡萄球菌可以逃避宿主防御機制和大多傳統(tǒng)的抗菌藥物治療[11]。研究表明,烏梅提取物濃度分別為12.5、25 mg/mL時,對SA分別達到高度敏感和極度敏感狀態(tài),MIC、MBC分別為6.25 mg/mL和12.5 mg/mL,表現(xiàn)出良好的抑菌作用。AKP位于SA細菌細胞壁和細胞膜間隙中,一般不向外分泌,當SA細胞壁遭到破壞,AKP才會進入胞液中,因此細胞外AKP含量變化可表明細菌細胞壁的完好性[8]。細胞膜是細菌的保護屏障,當烏梅水提取物作用SA后,細胞膜通透性增加,細胞漿內(nèi)的LDH、可溶性蛋白質(zhì)可釋放到培養(yǎng)液中[12],因此LDH水平、可溶性蛋白質(zhì)含量的變化可間接反映細菌細胞膜的通透性。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明,烏梅水提取物對SA的最低抑菌濃度為6.25 mg/mL、最小殺菌濃度為12.5 mg/mL。經(jīng)過烏梅水提取物處理后,SA的胞外AKP、LDH活性及胞外蛋白含量明顯增加,因此烏梅水提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用可能是通過破壞菌體細胞壁和細胞膜使細胞內(nèi)容物外泄所致。