赫翠,陳衛(wèi)軍,鄭萌玥,潘培妍,李聰,陳文,秦冬梅

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子 832002;2.新疆第二醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院,克拉瑪依 834000)

高脂血癥(hyperlipidemia ,HPL)是全球性的重大健康問題,其與非酒精性脂肪肝(NAFLD)密切相關(guān),HPL常常伴隨著NAFLD的出現(xiàn),且一旦出現(xiàn)一種代謝紊亂,其他并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)就會更高[1]。目前仍缺乏治療HPL的藥物,雖然一些西藥具有快速降脂作用,但它們會引起肝毒性等嚴(yán)重副作用[2],因此研究新的治療藥物迫在眉睫。

二黃祛脂方(EHQZF)是石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床上用于降脂的經(jīng)典復(fù)方,由甘草(GlycyrrhizauralensisFisch,GC)、丹參(SalviamiltiorrhizaBunge,DS)、荷葉(FoliumNelumbinis,HY)、大黃(RheumpalmatumL.,DH)、姜黃(CurcumalongaL.,JH)、虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt,HZ)、葛根(RadixPuerariae,GG)、白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz,BZ)、澤瀉(Alismaplantago-aquaticaL.,ZX)、絞股藍(lán)[Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino,JGL]、僵蠶(BombyxBatryticatus,JC)、水蛭(HirudonipponicaWhitman,SZ)和青礞石(LapisChloriti,QMS)13味中藥組成,袁今奇等[3]發(fā)現(xiàn)EHQZF可以通過降脂作用減輕NAFLD,但是,由于EHQZF藥材種類較多,價(jià)格昂貴,并且復(fù)方中含有較難收集的礦物藥(青礞石)和毒性較大的動物藥(水蛭),給患者臨床應(yīng)用造成一定的困擾,因此對EHQZF進(jìn)行精簡并重新組方具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興學(xué)科,其可通過“網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)、多組分療法”幫助闡明中藥復(fù)方治療疾病的復(fù)雜分子機(jī)制[4]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測EHQZF治療HPL的關(guān)鍵中藥及有效成分,利用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)鑒別關(guān)鍵化合物,將EHQZF抗HPL的關(guān)鍵中藥按照Degree值排序,組方為QZF-Ⅰ(甘草、丹參、荷葉、大黃),按照處方量排序,組方為QZF-Ⅱ(虎杖、丹參、荷葉、姜黃),采用Tyloxapol誘導(dǎo)ICR小鼠高脂血癥,Tyloxapol是一種非離子表面活性劑,可阻斷血漿脂解活性并在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)富含TG的脂蛋白[5],該方法可用于建立急性高血脂模型,該模型與NAFLD也密切相關(guān)[6]。利用該模型比較EHQZF、QZF-Ⅰ、QZF-Ⅱ三個復(fù)方降血脂的效果,篩選出抗HPL較優(yōu)的處方。

1 材料與方法

1.1藥物 ZX(批號:20060211)、GC(批號:20041521)、GG(批號:20011431)、BZ(批號:20040441)、HY(批號:20030291)、HZ(批號:19121441)、JH(批號:20080341)、JGL(批號:20020291)、DS(批號:20070501)、DH(批號:20070631)、JC(批號:19101851)、QMS(批號:19111941)和SZ(批號:20050441)均購自江陰天江藥業(yè)有限公司,組方顆粒經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院袁今奇教授鑒定,均符合《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定。

1.2試劑 甲醇(批號:MSDS-20190426,貨號:CAEQ-4-003302-4000)、乙酸(批號:MSDS-20170627,貨號:CAEQ-4-011245-0500)、乙腈(貨號:CAAH-1-00030-4000)均購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;氫氧化鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號:20190310);鹽酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號:20200318);乙酸乙酯(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司,批號:20201020);1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH,上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司,批號:GTBXB-QP,貨號:D4313);抗壞血酸(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司,批號:180710,貨號:D10001);2,2-連氨基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司,批號:180305,貨號:F0001);過硫酸鉀(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司,批號:20161019,貨號:W510055);4%多聚甲醛(北京雷根生物技術(shù)有限公司,批號:0618A21,貨號:DF0135);Tyloxapol(美國Sigma公司,批號:MKCK7328,貨號:T0307-5G);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT,批號:20210329,貨號:C009-2-1)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST,批號:20210329,貨號:C10-2-1)、三酰甘油(TG,批號:20210318,貨號:A110-1-1)、總膽固醇(TC,批號:20210318,貨號:A111-1-1)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C,批號:20210329,貨號:A112-1-1)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C,批號:20210416,貨號:A113-1-1)、丙二醛(MDA,批號:20211207,貨號:A003-1)、超氧化物歧化酶(SOD,批號:20211204,貨號:A001-1)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供;大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β,批號:20201218,貨號:SEKM0002)、大鼠IL-6(批號:20201218,貨號:SEKM0007)試劑盒均由北京索萊寶科技有限公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體(SPF)級ICR小鼠36只,雌雄各半,體質(zhì)量18～25 g,購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2018-0002。小鼠于室溫(23±2)℃、相對濕度約50%,12/12 h光暗交替的條件下進(jìn)行飼養(yǎng),自由攝食飲水,在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,動物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照石河子實(shí)驗(yàn)動物管理法規(guī)的規(guī)定和總則建議進(jìn)行。

1.4儀器 5426XG型離心機(jī)(德國艾本德股份公司);BP211D型分析天平(德國賽多利斯,感量:0.01 mg);Varioskan LUX型多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific,USA);VORTEX0型渦旋混勻器(上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司);SKY-100B型恒溫?fù)u床(上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)。

1.5活性成分的收集與篩選 在ETCM數(shù)據(jù)庫(tcmip.cn/ETCM/)[7]、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(organchem.csdb.cn/scdb/default.htm)、TCMSP數(shù)據(jù)庫(tcmspw.com/ tcmsp.php)[8]、TCMID數(shù)據(jù)庫(megabionet.org/tcmid)[9]、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[10]和SymMap數(shù)據(jù)庫(symmap.org/SymMap)[11]中檢索EHQZF的13味藥所含的化學(xué)成分,利用PubChem數(shù)據(jù)庫(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[12]查找化合物的標(biāo)準(zhǔn)SMILES式,上傳至FAFDrugs4數(shù)據(jù)庫(fafdrugs4.mti.univ-parisdiderot.fr/)[13],將“PhysChem Filters”設(shè)置為“Drug-Like Soft”,當(dāng)ADMET評估的結(jié)果為“Accepted”時,化合物被選為潛在的活性成分。

1.6活性成分的作用靶點(diǎn)收集 利用ChEMBL數(shù)據(jù)庫(ebi.ac.uk/chembl/)[14]、TCMSP數(shù)據(jù)庫、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(swisstargetprediction.ch/)[15]和ETCM數(shù)據(jù)庫收集活性成分靶點(diǎn),限制物種為“Homo sapiens”。在ETCM中,設(shè)置候選目標(biāo)基因的置信度得分≥0.80,在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中,選擇“probability>0”的靶點(diǎn)。合并收集到的靶點(diǎn),刪除重復(fù)值后將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(uniprot.org/)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,即可得到活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.7復(fù)方治療HPL的靶點(diǎn)預(yù)測 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(genecards.org/)[16]、OMIM數(shù)據(jù)庫(omim.org/)[17]、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(disgenet.org/)[18]、CTD數(shù)據(jù)庫(ctdbase.org/)[19]中以“Hyperlipidemia”為關(guān)鍵詞查詢HPL靶點(diǎn),將HPL靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,刪除重復(fù)值后,將EHQZF與HPL靶點(diǎn)上傳至聯(lián)川生物云平臺(omicstudio.cn/index)制作Venn圖,交集即為EHQZF治療HPL的作用靶點(diǎn),將作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺,限定物種為“homo”,將network display options設(shè)置為“hide disconnected nodes in the network”,獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),采用Cytoscape軟件中的Network Analyzer對PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)進(jìn)行自由度分析,篩選出Degree值≥2倍中位數(shù)的靶點(diǎn),作為后續(xù)分析的核心靶點(diǎn)。

1.8LC-MS樣品溶液的制備 檢測EHQZF中酚酸類化合物時,用70%甲醇溶液2 mL提取EHQZF樣品約100 mg,每次使用超聲波提取30 min,共2 h,之后35 ℃減壓濃縮至干燥,檢測EHQZF中黃酮類化合物時,先用4 mol·L-1氫氧化鈉水溶液2 mL處理EHQZF樣品約100 mg,40 ℃水解2 h,通過滴加4 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2,加入正己烷2 mL,晃動20 min,除去正己烷層,用乙酸乙酯(2×2 mL)提取水層,濃縮至干燥。在分析之前,將殘余物溶解在50%甲醇200 μL中,并轉(zhuǎn)移到配有插入裝置的小瓶中。

1.9LC-MS色譜條件 采用Thermo ScientificTMQ ExactiveTM聯(lián)合四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀和Waters HSS T3色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)進(jìn)行LC-MS分析,質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下:采用電噴霧離子源;鞘氣40 arb;輔助氣10 arb;離子噴霧電壓為-2800 V;溫度350 ℃,離子傳輸管溫度320 ℃,流速0.3 mL·min-1;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL;掃描模式為單離子檢測模式;掃描方式為負(fù)離子。檢測酚酸類化合物時流動相為乙腈(B相)-0.1%甲酸溶液(A相),其梯度洗脫過程為0～2 min(90：10),6～9 min(40：60),9.1～12 min(90：10);檢測黃酮類化合物時流動相為乙腈(B相)-0.1%乙酸溶液(A相),其梯度洗脫過程為0～2 min(90：10),6～8 min(40：60),8.1～12 min(90：10)。數(shù)據(jù)用TraceFinder軟件進(jìn)行特征提取和預(yù)處理,然后采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.10EHQZF及其精簡方對DPPH自由基清除能力的測定 用無水乙醇配制不同濃度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg·mL-1)的EHQZF、QZF-Ⅰ、QZF-Ⅱ和BTBT溶液,取上述溶液1.0 mL,加0.1 mmol·L-1DPPH無水乙醇溶液2.0 mL,混勻,靜置30 min,混勻后在室溫條件下暗反應(yīng)30 min,測定517 nm波長處的吸光度值(A1),取0.1 mmol·L-1DPPH無水乙醇溶液1 mL加入無水乙醇2 mL。在517 nm波長處測定其吸光度值(A0),以VC作陽性組,按公式計(jì)算DPPH的清除率[20]。

SA%=(A0-A1)/A0×100%

(1)

A0:DPPH與溶劑混合液吸光度;A1:DPPH與各樣品反應(yīng)后吸光度。

1.11EHQZF及其精簡方對ABTS自由基清除能力的測定 取7 mmol·L-1ABTS溶液5 mL與140 mmol·L-1過硫酸鉀88 μL混合,在室溫避光條件下反應(yīng)16 h制成ABTS儲備液。取上述ABTS儲備液0.1 mL加入純化水5 mL稀釋至該溶液在734 nm處吸光度值為0.695～0.705,即得ABTS工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。取無水乙醇0.3 mL加入ABTS工作液2.7 mL作為空白組,振蕩混合后,室溫避光反應(yīng)30 min,在734 nm波長處測定其吸光度值(A0)[21]。用無水乙醇配制不同質(zhì)量濃度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg·mL-1)EHQZF、QZF-Ⅰ、QZF-Ⅱ 和BTBT溶液,以VC作陽性組。取樣品溶液0.3 mL于ABTS工作液2.7 mL中,充分振蕩后,避光反應(yīng)30 min,在734 nm波長處測定吸光度值(A1)(重復(fù)3次)。按公式(2)計(jì)算清除率:

SA(%)=(A0-A1)/A0×100%

(2)

A0:ABTS與溶劑混合液的吸光度;A1:ABTS與各樣品反應(yīng)后的吸光度。

1.12藥液的制備及劑量設(shè)置 EHQZF的臨床每日給藥劑量為(顆粒量):JH 0.6 g、DH 3 g、JC 1 g、JGL 1 g、BZ 3 g、GG 1 g、HY 0.5 g、ZX 1 g、DS 2 g、HZ 1 g、SZ 0.5 g、QMS 0.5 g、GC 1 g,參照臨床劑量將本實(shí)驗(yàn)藥物劑量從原料藥劑量轉(zhuǎn)換為中藥提取物顆粒劑量,并根據(jù)體表面積等效劑量轉(zhuǎn)換法轉(zhuǎn)換為小鼠劑量,則給藥劑量為2.4 g·kg-1,取以上13味中藥的顆粒劑量制成EHQZF,QZF-Ⅰ和QZF-Ⅱ中藥味的劑量與其在全方中的劑量相同,即取甘草顆粒：丹參顆粒：荷葉顆粒：大黃顆粒=1：2：0.5：3,制成QZF-Ⅰ,取虎杖顆粒：丹參顆粒：荷葉顆粒：姜黃顆粒=1：2：0.5：0.6,制成QZF-Ⅱ,混合后,均用60 ℃純化水制成藥液服用,經(jīng)石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室進(jìn)行質(zhì)量控制檢測。

1.13HPL小鼠模型建立及指標(biāo)檢測 取ICR小鼠,隨機(jī)分為CON組、HPL組、EHQZF組(2.4 g·kg-1)、QZF-Ⅰ組(2.4 g·kg-1)、QZF-Ⅱ組(2.4 g·kg-1)和BZBT組(60.67 mg·kg-1),除CON組和HPL組給予純化水外,其余各組灌胃給予相應(yīng)藥物,早晚各給藥一次,持續(xù)13 d,第13 天時,末次給藥1 h后,除CON組,其余各組腹腔注射500 mg·kg-1Tyloxapol,禁食不禁水14 h后,將小鼠安樂死,取血清檢測ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C、MDA及SOD含量,取肝組織勻漿檢測IL-6、IL-1β含量,利用蘇木精-伊紅(HE)染色和油紅O染色進(jìn)行病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1EHQZF抗HPL的核心靶點(diǎn)的篩選 結(jié)果見圖1。EHQZF和HPL共有交集靶點(diǎn)532個,將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,通過Cytoscape 3.9.0對圖像可視化,以節(jié)點(diǎn)表示蛋白,以邊表示節(jié)點(diǎn)間的相互作用,Degree值表征連接到該節(jié)點(diǎn)的邊數(shù),以此來反映節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性,圖示節(jié)點(diǎn)越大,表示該Degree值越大,交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點(diǎn)527個,14 577條邊,Degree值中位數(shù)為78,以Degree>78的靶點(diǎn)作為EHQZF治療HPL的核心靶點(diǎn),核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)共有119個節(jié)點(diǎn),4555條邊。

圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心作用靶點(diǎn)的篩選

2.2“中藥-活性化合物-核心靶點(diǎn)”的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了篩選EHQZF治療HPL的關(guān)鍵中藥及關(guān)鍵化合物,構(gòu)建了“中藥-活性化合物-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。根據(jù)Degree值將EHQZF治療HPL的中藥的重要性進(jìn)行排序:甘草(GC,Degree=133)>丹參(DS,Degree=87)>荷葉(HY,Degree=66)>大黃(DH,Degree=63)>姜黃(JH,Degree=35)>虎杖(HZ,Degree=33)>葛根(GG,Degree=31)>白術(shù)(BZ,Degree=29)>澤瀉(ZX,Degree=27)>絞股藍(lán)(JGL,Degree=13)>僵蠶(JC,Degree=8)>水蛭(SZ,Degree=5),取Degree值排名前4位甘草、丹參、荷葉和大黃組方為QZF-Ⅰ。另外Degree值排名前10位的化合物為Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Resveratrol、Apigenin、Protocatechuic Acid、Genistein、Emodin、Daidzein和Ferulic Acid,均為黃酮類和酚酸類化合物。根據(jù)活性成分的作用靶點(diǎn)排名前10位為:PTGS2、ESR1、AR、PPARG、NFE2L2、F2、GSK3B、MAPK14、NR3C1、PRKCA。

DS:丹參;HZ:虎杖;DH:大黃;JC:僵蠶;JH:姜黃;SZ:水蛭;HY:荷葉;QMS:青礞石;GC:甘草;JGL:絞股藍(lán);BZ:白術(shù);ZX:澤瀉;GG:葛根;六邊形代表中藥,錐形代表活性成分,正方形代表核心靶點(diǎn),線條代表它們之間的相互作用。

2.3LC-MS定性及定量結(jié)果 EHQZF所含酚酸類和黃酮類化學(xué)成分如圖3和表1所示,其中Gallic acid、Catechin、Protocatechuic acid、trans-cinnamic acid、Caffeic acid等成分在EHQZF中的含量相對較多。

表1 EHQZF黃酮類和酚酸類化學(xué)成分的含量測定結(jié)果

A.EHQZF中酚酸類化合物定性色譜圖;B.EHQZF中黃酮類化合物定性色譜圖;1.沒食子酸;2.L-苯丙氨酸;3.原兒茶酸;4.原兒茶醛;5.香草酸;6.咖啡酸;7.丁香酸;8.香草素;9.對羥基苯甲酸;10.對羥基肉桂酸;11.丁香醛;12.水楊酸;13.反阿魏酸;14.芥子酸;15.苯甲酸;16.氫化肉桂酸;17.反式肉桂酸;18.兒茶素;19.表兒茶素;20.二氫楊梅素;21.蘆丁;22.牡荊素;23.槲皮素-3-O-葡萄糖苷;24.(+)-紫杉醇;25.槲皮苷;26.(+)-二氫山奈酚;27.木犀草素;28.槲皮素;29.柚皮苷查爾酮;30.芹菜素;31.柚皮苷;32.山奈酚;33.異鼠李苷。

2.4EHQZF及其精簡方對ABTS和DPPH的影響 結(jié)果見圖4。在0.2～0.6 mg·mL-1范圍內(nèi),EHQZF及其精簡方對ATBS和DPPH的清除能力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增加,自由基清除能力VC>QZF-Ⅰ>QZF-Ⅱ>EHQZF>BZBT,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.6～1.0 mg·mL-1,ATBS的清除能力VC>QZF-Ⅰ>QZF-Ⅱ>EHQZF>BZBT,DPPH的清除能力QZF-Ⅰ>QZF-Ⅱ≈EHQZF>BZBT。QZF-Ⅰ對ATBS和DPPH的清除能力較好。

圖4 EHQZF及其精簡方的體外抗氧化能力(n=3)

2.5EHQZF及其精簡方對HPL小鼠血清氧化指標(biāo)的影響 結(jié)果見圖5。與CON組比較,HPL組小鼠血清中MDA水平顯著升高,T-SOD水平顯著降低(P<0.01),與HPL組比較,EHQZF、QZF-Ⅰ、QZF-Ⅱ、BZBT均可降低MDA水平,升高T-SOD水平(P<0.05或P<0.01),其中BZBT降低血清MDA效果最好,其次是EHQZF,QZF-Ⅰ與QZF-Ⅱ效果相當(dāng),QZF-Ⅱ升高血清SOD的效果最好(P<0.05),其次是EHQZF、QZF-Ⅰ和BZBT。結(jié)果表明,EHQZF及其精簡方在HPL小鼠中表現(xiàn)出明顯的抗氧化能力,其中QZF-Ⅱ能力較強(qiáng)。

①與CON組比較,t=10.06,3.976,P<0.01;②與HPL組比較,t=3.449,2.579,P<0.05。

2.6EHQZF及其精簡方對HPL小鼠肝損傷指標(biāo)的影響 結(jié)果見圖6。與CON組比較,HPL組小鼠血清中ALT和AST水平較高(P<0.05或P<0.01),與HPL組比較,EHQZF、QZF-Ⅰ、QZF-Ⅱ均可降低小鼠血清中ALT和AST水平(P<0.05或P<0.01),其中QZF-Ⅱ效果較好,結(jié)果表明,EHQZF及其精簡方在HPL小鼠中表現(xiàn)出明顯的抗肝損傷能力,其中QZF-Ⅱ能力較強(qiáng)。

①與CON組比較,t=6.977,3.821,P<0.01;②與HPL組比較,t=2.599～4.207,P<0.05;③與HPL組比較,t=4.328,6.602,P<0.01。

2.7EHQZF及其精簡方對HPL小鼠血脂四項(xiàng)的影響 結(jié)果見圖7。HPL組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平較CON組顯著升高,而HDL-C水平較CON組顯著降低(P<0.01),EHQZF、QZF-Ⅰ、QZF-Ⅱ組均可降低血清TG、TC、LDL-C水平,升高HDL-C水平(P<0.01),其中QZF-Ⅱ降低TC、TG水平的能力較強(qiáng),QZF-Ⅰ降低LDL-C水平的能力較強(qiáng),EHQZF及QZF-Ⅰ升高HDL-C水平的能力較強(qiáng)。

①與CON組比較,t=6.982～29.610,P<0.01;②與HPL組比較,t=3.306～10.150,P<0.01;③與HPL組比較,t=2.647,P<0.05。

2.8EHQZF對HPL小鼠肝組織勻漿炎癥因子的影響 結(jié)果見圖8。與HPL組比較,QZF-Ⅰ對IL-1β水平的影響不大,EHQZF及QZF-Ⅱ可明顯減少IL-1β含量,其中QZF-Ⅱ減少IL-1β含量效果較好(P<0.01);與CON組比較,HPL組小鼠IL-6含量顯著升高(P<0.05),EHQZF及QZF-Ⅱ 可明顯減少IL-6含量,其中QZF-Ⅱ減少IL-6含量效果較好(P<0.01)。結(jié)果表明,EHQZF及QZF-Ⅱ可以降低HPL小鼠肝臟炎癥因子的含量,而QZF-Ⅱ的抗炎能力最強(qiáng)。

①與CON組比較,t=4.009,P<0.05;②與CON組比較,t=9.144,P<0.01;③與HPL組比較,t=4.194～14.710,P<0.01。

2.9EHQZF及其精簡方對小鼠血清澄清度及肝臟形態(tài)的影響 結(jié)果見圖9。與CON組比較,HPL組小鼠血清渾濁,呈乳白色;肝臟輪廓模糊,顏色發(fā)黃,表面粘連;肝組織出現(xiàn)嚴(yán)重破損,炎癥細(xì)胞浸潤明顯,肝細(xì)胞腫大,呈空泡狀,有大量脂滴蓄積;EHQZF、QZF-Ⅰ、QZF-Ⅱ組小鼠血清恢復(fù)成半透明狀、肝臟的外觀有所改善,空泡減少,炎癥細(xì)胞浸潤減輕,脂滴蓄積減少,其中QZF-Ⅱ治療效果較好。結(jié)果表明,EHQZF、QZF-Ⅰ、QZF-Ⅱ均具有減少血清脂質(zhì)蓄積,降低肝臟炎癥和脂滴聚集的作用,其中QZF-Ⅱ效果最好。

圖9 EHQZF及其精簡方對HPL小鼠血清澄清度、肝臟形態(tài)、肝組織病理情況、肝臟脂滴聚集的影響

3 討論

臨床驗(yàn)證EHQZF降血脂及防治NAFLD作用顯著,但是該復(fù)方由13味藥材組成,成本較高,且其防治高血脂的主要藥材及有效成分不甚清晰,不利于該復(fù)方的推廣。因此,本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測EHQZF抗HPL的關(guān)鍵中藥及有效成分,從而精簡復(fù)方,分別組方為QZF-Ⅰ和QZF-Ⅱ。據(jù)報(bào)道,丹參可活血祛瘀,臨床上主要用于抗氧化、降脂保肝等作用[22];荷葉可化濕清陽,具有抗肥胖和抗高TG的作用[23];姜黃是天然抗氧化劑,具有清除自由基、降血脂的潛力[24];虎杖具有利濕、清熱、散瘀的功能[25];甘草可有效治療高血脂和肝細(xì)胞脂肪變性[26];大黃可通過降低血液中ALT和TG水平,起到抗HPL的作用[27]。另外,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合LC-MS結(jié)果表明,黃酮類和酚酸類化合物是EHQZF抗HPL的主要有效成分,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類和酚酸類化合物為中藥主要有效成分,其可通過降低脂肪蓄積、抑制炎癥、抗氧化從而抑制高脂血癥[28]。

氧化自由基可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,與HPL和NAFLD均有關(guān)[29],在氧化脂質(zhì)的生產(chǎn)過程中,MDA促進(jìn)機(jī)體發(fā)生氧化反應(yīng)[30],而SOD則是機(jī)體內(nèi)抵抗氧化反應(yīng)發(fā)生的酶,其可減少活性氧自由基的產(chǎn)生,防止代謝產(chǎn)物破壞機(jī)體[31]。本研究發(fā)現(xiàn),EHQZF和QZF-Ⅱ抑制MDA水平,升高SOD水平的能力好于QZF-Ⅰ,而抑制ABTS和DPPH自由基的能力略差于QZF-Ⅰ,體內(nèi)外抗氧化能力不同,可能是由于復(fù)方通過灌胃進(jìn)入機(jī)體時部分有效成分無法被身體吸收而被排除體外,體外則保留更多的有效成分,而本處方主要是針對患者臨床使用,以體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為主。因此,EHQZF和QZF-Ⅱ抗氧化能力更好。高脂血癥臨床表現(xiàn)為LDL-C、TG和TC含量增多,HDL-C含量減少[32]。因此,降低血脂水平是預(yù)防或延緩高脂血癥形成的關(guān)鍵方法,筆者發(fā)現(xiàn)EHQZF提高血清HDL-C含量、降低TG含量更優(yōu),QZF-Ⅱ減少血清TC含量更優(yōu)。ALT、AST是肝損傷的重要指標(biāo)[33],結(jié)果表明Tyloxapol導(dǎo)致小鼠血清中ALT、AST含量明顯升高,小鼠出現(xiàn)肝損傷,而EHQZF、QZF-Ⅰ、QZF-Ⅱ均可以降低血清ALT、AST水平,其中QZF-Ⅱ效果更好,說明QZF-Ⅱ的保肝作用更強(qiáng)。炎癥在高血脂的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,它受IL-1β和IL-6等炎癥因子的調(diào)節(jié)[34],在本研究中,EHQZF和QZF-Ⅱ可降低小鼠肝組織勻漿中IL-6、IL-1β含量,QZF-Ⅱ抗炎效果更好,而QZF-Ⅰ無明顯的抗炎作用。另外,Tyloxapol誘導(dǎo)急性高血脂的過程往往伴隨著肝臟炎癥和脂肪積累[35],EHQZF、QZF-Ⅰ和QZF-Ⅱ均可改善血清澄清度,減輕肝組織炎性細(xì)胞浸潤和脂滴蓄積,且QZF-Ⅱ效果更好。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),QZF-Ⅱ在提高血清SOD水平、降低血清肝損傷指標(biāo)(ALT和AST)水平、抑制炎癥因子(IL-1β和IL-6)水平,降低血清TC含量,抑制肝臟炎癥和肝臟脂滴蓄積能力方面更優(yōu)。EHQZF在降低血清MDA水平、提高HDL-C含量、下調(diào)血清TG含量方面更優(yōu),QZF-Ⅰ在體外抑制ABTS和DPPH自由基方面更優(yōu),綜合比較發(fā)現(xiàn),EHQZF和QZF-Ⅱ改善HPL能力更好,兩者均可以通過抗氧化、抑制肝組織損傷、減輕肝臟炎癥,降低肝臟脂滴蓄積來抗HPL,其中QZF-Ⅱ含有較少味中藥,相較于EHQZF在治療HPL方面,卻起到更優(yōu)的治療效果,這對其臨床應(yīng)用具有一定的借鑒意義。