徐文昌,朱敏杰
(四川省簡陽市植保植檢站,四川 簡陽 641400)
殺菌劑在整個植物病害防控中扮演著重要的角色,作用迅速且高效穩(wěn)定,殺菌劑的生產(chǎn)和使用量占比在逐年加大[1]。近年來殺菌劑新品種的開發(fā)取得很大進展,如三唑類、酰胺類、嘧啶胺類、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑等,其特點是不僅活性高、作用機理獨特、對環(huán)境友好[2-3]。但隨著殺菌劑應(yīng)用比例的增長,植物病原菌的抗藥性也逐漸增強,因此仍需持續(xù)開發(fā)研究新的殺菌劑種類。丙硫唑(Albendazole)又名丙硫咪唑、丙硫多菌靈,化學(xué)名稱為5-丙硫基-1-H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯,是苯并咪唑(Benzimidazole)類的衍生化合,結(jié)構(gòu)如圖1所示。丙硫唑最早由Gyuri和Theodorides合成,并于1977年由美國Smith Kline公司研制成功并上市,該藥在臨床上被廣泛用于治療蠕蟲感染導(dǎo)致的疾病菌,對人體及動物寄生蟲如線蟲、吸蟲、絳蟲等均有很強的驅(qū)殺作用[4]。作為殺菌劑防治植物病害方面少有報道,并多以其他殺菌劑復(fù)配的形式使用。
圖1 丙硫唑的結(jié)構(gòu)式
小麥赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw)引起的一種真菌性病害,在生產(chǎn)中造成小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的顯著降低[5]。小麥受到赤霉菌侵染后,病菌會迅速在穗部擴展,在籽粒灌漿成熟過程中不斷繁殖生長并在籽粒中產(chǎn)生多種毒素[6],包括雪腐鐮孢菌烯醇(NIV)化學(xué)型、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)與15-乙酰脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(15-ADON)化學(xué)型等,對小麥生產(chǎn)和人畜健康構(gòu)成嚴重威脅[7]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是已知的單端孢霉烯族化合物中毒性最強的一種,可引起人和動物的嘔吐、腹瀉、頭暈等的中毒癥狀,嚴重時可損害造血系統(tǒng)而導(dǎo)致死亡[8]。此外,DON具有細胞毒性、免疫毒性、遺傳毒性及致疇性和致癌性等,具有致癌、致畸和致突變作用[9-10]。目前尚未有報道丙硫唑影響小麥赤霉病菌產(chǎn)毒素量相關(guān)研究。毒素的檢測方法有理化檢測法、免疫化學(xué)測定法,現(xiàn)已建立了薄層色譜(Thin layer chromatography,TCL)、氣相色譜(Gas chromatography,GC)、高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)等方法[11-12]。
FgNIV:產(chǎn)NIV毒素的禾谷鐮孢菌(F.Graminearum)、Fg15ADON:產(chǎn)15AD毒素的禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、蘋果黑斑病菌(Alternariaalternata)、黃瓜褐斑病菌(Corynesporacassiicola)、葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、草坪枯萎病菌(Rhizoctoniasolani)、梨樹黑星病菌(Venturiapirina)、馬鈴薯早疫病菌(Alternariasolani)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、小新殼梭孢菌(Neofusicoccumparvum)、以上15種病原菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)無公害農(nóng)藥研究實驗室提供。
98%丙硫唑原藥、10%丙硫唑懸浮劑、75%三環(huán)唑可濕粉劑由貴州道元生物技術(shù)有限公司提供。
采用菌絲生長速率法[13],以丙硫唑原藥作為藥劑處理組,將直徑為5mm的供試菌分別接種于含10個濃度梯度(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL)的平皿中央,28℃恒溫培養(yǎng),待對照平板上菌落長到培養(yǎng)皿2/3左右,十字交叉法測定菌落直徑(mm)計算抑制率,根據(jù)抑制率,按機率值分析法,并通過軟件計算菌絲生長的EC50值。
試驗設(shè)3個處理:每667m2施用10%丙硫唑懸浮劑1500倍(A1),1000倍(A2)、500倍(A3)和對照藥劑250g/L戊唑醇水乳劑1250倍(B)及清水對照(CK),每個處理3個重復(fù),隨機排列。除試驗設(shè)計外,各處理區(qū)其他管理方式一致。施藥前調(diào)查紋枯病的發(fā)病基數(shù);分別施藥3次并在末次施藥的后20 d調(diào)查香蕉葉斑病發(fā)生情況,采用隨機5點取樣法,每個點5株苗選取中間3株,每株掛牌標記調(diào)查所有葉片的葉斑。各取樣點檢查每張葉片上所有病斑所占整張葉片的面積,按病斑面積比例分級記錄,統(tǒng)計小區(qū)調(diào)查總?cè)~片數(shù)和病級值,計算病情指數(shù)及防治效果。
香蕉葉斑病病情分級標準:0級:葉片無病斑;1級:葉片病斑面積占全葉片5%以下;3級:葉片病斑面積占全葉片6%~15%;5級:葉片病斑面積占全葉片16%~25%;7級:葉片斑面積占全葉片26%~50%;9級:葉片病斑面積占全葉片50%以上。
相對防治效率=
1.5.1 樣品的制備 在250mL三角瓶中加入100mLGYEP培養(yǎng)基,每瓶接種5×104個孢子,然后于28℃,黑暗條件下,在200 rpm的搖床上培養(yǎng),24h后加入相應(yīng)劑量的藥劑,每個菌株進行4個處理,分別為:不加藥劑的空白處理、加入EC20濃度的藥劑處理以及加入EC50濃度的藥劑處理,每處理3次重復(fù)。繼續(xù)搖培7 d后,培養(yǎng)物用尼龍布及濾紙過濾,得菌絲與濾液,菌絲烘干稱重,濾液量得總體積并記錄。取30mL濾液用等體積乙酸乙酯萃取2次,合并有機相后減壓蒸餾干燥,用1mL乙腈溶解,轉(zhuǎn)移到新離心管,待測。
1.5.2 樣品檢測 高效液相色譜分離的條件為:色譜柱為Shim-pack GIST(5μm C18,4.6×250mm);柱溫25 °C;進樣量5μL;流速0.8mL/min:檢測波長218 nm:流動相:A為超純水,B為乙腈,采用線性梯度洗脫:0~10min,A相為85%;10~22min,A相降為75%;22~30min,22~30min,A相升至85%。采用以上色譜條件對樣品進行定性定量分析。平衡色譜柱,單次樣品運行時間30min。采用以上色譜條件對樣品進行定性定量分析。
液體培養(yǎng)基GYEP中的菌絲產(chǎn)量通過干菌絲稱量獲得。液體搖培條件下,菌株產(chǎn)毒素能力用單位干菌絲量的總毒素產(chǎn)生量來衡量,單位為μg/mL。
采用Excel和SPSS等軟件處理數(shù)據(jù)。
通過丙硫唑?qū)?4種不同植物病原菌的室內(nèi)毒力測定見表1,結(jié)果表明丙硫唑?qū)?4種植物病原菌均有一定的抑菌作用,其中對馬鈴薯早疫病菌、可可毛色二孢菌、小新殼梭孢菌、葡萄座腔菌有顯著的抑菌作用,其EC50分別為6.1976μg/mL、6.5518μg/mL、15.4846μg/mL、20.3559μg/mL。
表1 丙硫唑?qū)?4種不同植物病原菌的室內(nèi)毒力測定
通過表2可知,在末次施藥后20d,各處理組對香蕉葉斑病的田間防治效果分別為57.76%、71.06%、80.45%、72.20%。末次藥后20 d防效的差異顯著性分析表明,10%丙硫唑懸浮劑的3種濃度防治效果存在極顯著差異,濃度越高,防治效果越好。但10%丙硫唑懸浮劑1000倍稀釋液與對照250g/L戊唑醇水乳劑1250倍稀釋液間防治效果沒有顯著差異。
表2 10%丙硫唑懸浮劑對香蕉葉斑病的田間防效
2.3.1 建立標準曲線 采用高效液相色譜法同時將禾谷鐮孢菌復(fù)合種的毒素NIV、DON、15ADON、3ADON分開,如圖2所示,保留時間分別為NIV,4.084min;DON,6.212min;15ADON,22.190min;3ADON,26.784min。圖3為色譜檢測峰面積與標準工作液濃度建立的標準曲線,可見目標峰峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。
圖2 分離4種毒素的高效液相色譜圖
圖3 3種毒素的標準曲線
2.3.2 丙硫唑?qū)gNIV產(chǎn)NIV毒素含量的影響 結(jié)果如表3所示,產(chǎn)NIV毒素的禾谷鐮孢菌,分別經(jīng)過EC20和EC50丙硫唑藥劑處理之后,其NIV毒素積累量明顯下降,相比CK對照組分別下降了17.28%和29.78%。產(chǎn)Fg15ADON毒素的禾谷鐮孢菌,分別經(jīng)過EC20和EC50丙硫唑藥劑處理后,產(chǎn)DON、15ADON毒素積累量顯著降低。產(chǎn)DON毒素相比CK對照組分別下降了19.69%、36.35%,產(chǎn)15ADON毒素相比CK對照組分別下降了19.04%、31.56%。部分樣品檢測圖如圖4。
表3 丙硫唑?qū)π←湷嗝共【舅睾康挠绊?/p>
圖4 部分樣品檢測圖注:a:NIV-CK;b:NIV-EC20處理;c:NIV-EC50處理;d:Fg15-CK產(chǎn)15ADON平均濃度;e:Fg15-EC20處理產(chǎn)15ADON平均濃度;f:Fg15-EC50處理產(chǎn)15ADON平均濃度;g:Fg15-CK產(chǎn)DON平均濃度;h:Fg15-EC20處理產(chǎn)DON平均濃度;i:Fg15-EC50處理產(chǎn)DON平均濃度。
殺菌劑是目前植物病害防治中最高效的防治手段[14],丙硫唑又是一種低毒、高效的醫(yī)藥且在植物病害防治方面的研究較少。石婭瓊[15]發(fā)現(xiàn)10%丙硫唑懸浮劑對辣椒炭疽病和水稻稻瘟病等病害具有抑制作用。葉火春等[16]人研究得出丙硫唑與溴菌腈復(fù)配使用對杧果細菌性角斑病菌的防治有協(xié)同增效的作用。本研究通過室內(nèi)毒力測定丙硫唑?qū)?4種植物病原菌均有一定的抑菌作用,說明丙硫唑具有廣譜殺菌性。10%丙硫唑懸浮劑的3種濃度防治效果存在極顯著差異,濃度越高,防治效果越好。同時10%丙硫唑懸浮劑1000倍稀釋液與對照250g/L戊唑醇水乳劑1250倍稀釋液間防治效果沒有顯著差異,說明10%丙硫唑懸浮劑對香蕉葉斑病具有較好的田間防治效果。
小麥受到赤霉菌侵染后在籽粒中產(chǎn)生多種毒素,包括雪腐鐮孢菌烯醇(NIV)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)與15-乙酰脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(15-ADON)等。這類毒素具有細胞毒性,可以穿過生物屏障,影響消化、免疫、內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng),會引起嘔吐、腹痛、眩暈等癥狀[17-18]。現(xiàn)尚未有報道丙硫唑?qū)π←湷嗝共【a(chǎn)毒素影響相關(guān)的研究,本文通過高效液相色譜法發(fā)現(xiàn),產(chǎn)NIV毒素的禾谷鐮孢菌,經(jīng)過EC20、EC50丙硫唑藥劑處理之后,其NIV毒素積累量明顯降低,產(chǎn)Fg15ADON毒素的禾谷鐮孢菌經(jīng)EC20、EC50藥劑處理后,產(chǎn)DON、15ADON毒素積累量明顯降低,說明一定濃度的丙硫唑?qū)π←湷嗝共【薪刀舅氐淖饔谩?/p>