李曉龍，張文亮,2，官萌嬌，劉 冰，管圓圓，任愛(ài)芝，趙培寶*

（1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000；2.莘縣自然資源和規(guī)劃局，山東莘縣 252000）

聊紅椿是我們團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)多年選育得到的紅果臭椿新品種（證書(shū)號(hào)：20190262），翅果顏色鮮紅，燦爛如霞，具有較高的觀賞價(jià)值和廣闊的推廣前景[1]。紅果臭椿是臭椿的一個(gè)變種，大型落葉喬木，對(duì)土壤的適應(yīng)力強(qiáng)，可以改善環(huán)境，不僅果實(shí)艷麗，而且木材優(yōu)良，用途廣泛，是城鄉(xiāng)綠化的優(yōu)良樹(shù)種[2]。

王教敏調(diào)查采集臭椿的病樣組織進(jìn)行分離觀察，經(jīng)過(guò)致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)炭疽病的致病菌致病性強(qiáng)，嚴(yán)重影響臭椿的生長(zhǎng)，降低臭椿的價(jià)值[3]。王樹(shù)和等在河南省的調(diào)查發(fā)現(xiàn)臭椿炭疽病主要為害葉片，病斑呈圓形褐色，經(jīng)過(guò)病斑組織分離、形態(tài)學(xué)觀察、柯赫氏驗(yàn)證、多位點(diǎn)基因系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)炭疽病的致病菌是果生炭疽菌[4]。有很多植物都會(huì)得炭疽病，韓小勇等采用柯赫氏法則對(duì)紫山藥炭疽病病斑組織進(jìn)行分離，對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，得到6 株致病菌，不同的致病菌致病力不同，其中致病力最強(qiáng)的是暹羅炭疽菌[5]。張世才等通過(guò)對(duì)重慶加工型辣椒的炭疽病進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)病原菌進(jìn)行分離和鑒定，確定致病菌為膠孢炭疽菌，并進(jìn)行了毒力測(cè)定找到了防治辣椒炭疽病的有效藥劑[6]。

本研究于2020年在聊城大學(xué)生態(tài)園采集病葉，經(jīng)分離純化得到一種炭疽菌，進(jìn)一步經(jīng)致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)及分子鑒定，確定炭疽病的致病菌是暹羅刺盤(pán)孢（Colletotrichum siamense），該研究結(jié)果為聊紅椿炭疽病防治奠定了基礎(chǔ)，也可為聊紅椿的推廣提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在2020 年8—10 月在聊城大學(xué)植物園內(nèi)采集聊紅椿葉部病害樣本；致病性測(cè)定供試健康幼苗是實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的聊紅椿幼苗，生長(zhǎng)時(shí)間120 d，健康無(wú)病害，長(zhǎng)勢(shì)一致。真菌培養(yǎng)采用PDA 培養(yǎng)基，所用化學(xué)藥品為國(guó)產(chǎn)分析純，分子試劑購(gòu)自泰安聯(lián)星公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)、上海博訊BSG-250 光照培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、PCR 儀、Olympus 光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿等。

1.3 病原菌的分離和純化

聊紅椿葉部病斑分離采用組織分離法。用無(wú)菌水對(duì)剛采集的新鮮病葉進(jìn)行清洗，用解剖刀從葉片病健交界處切取數(shù)塊邊長(zhǎng)為5 mm 正方形病組織[7]。將葉片生病組織分別放入75%的酒精中2～3 s，以達(dá)到表面消毒和淋濕組織表面目的，然后用5%次氯酸鈉對(duì)葉片表面消毒3～5 min，放入含有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中清洗3 遍，用無(wú)菌的吸水紙去掉組織表面水分。用滅菌的鑷子將材料移入PDA 培養(yǎng)基，每皿放5 片，將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。等到培養(yǎng)皿材料邊緣長(zhǎng)出菌絲物，用接種針進(jìn)行單胞分離來(lái)純化病原菌，直至培養(yǎng)出整齊一致的單個(gè)菌落[8]。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)觀察，在超凈工作臺(tái)上將分離純化好的菌絲接種于PDA 培養(yǎng)皿上，在25 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，每天觀察記錄菌落的形態(tài)特征[9]，用相機(jī)記錄菌落顏色變化；形態(tài)特征顯微觀察，用無(wú)菌針挑取少量病原菌制成臨時(shí)載玻片，在顯微鏡下觀察菌絲是否有隔、分生孢子的大小、顏色變化等形態(tài)特征[10]，記錄并拍照。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

收集菌絲，采用OMIGA 公司的DNA 試劑盒提取病原菌DNA[11-13]，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段，由濟(jì)南博尚公司進(jìn)行測(cè)序，最后進(jìn)行序列分析。ITS引物為通用引物（見(jiàn)表1）。

表1 ITS引物

PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃，5 min；然后每循環(huán)為94 ℃，30 s；50 ℃，45 s；72 ℃，45 s，32 個(gè)循環(huán)；繼續(xù)72 ℃，延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后電泳檢測(cè)。表2為PCR擴(kuò)增體系。

表2 PCR擴(kuò)增體系

電泳檢測(cè)正確后切膠回收目的條帶，方法為在凝膠成像系統(tǒng)下用刀片切下目的條帶，移至離心管（1.5 mL），采用DNA 凝膠回收試劑盒膠回收DNA 片段[14]。將純化回收后擴(kuò)增片段送濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

將測(cè)序公司反饋的有效序列在NCBI 網(wǎng)頁(yè)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選取同源序列DNA 序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，根據(jù)親緣關(guān)系來(lái)判斷菌株所屬真菌種類(lèi)[15-16]。

1.6 病原菌的致病性鑒定

采用柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定[17-18]，方法為在超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌打孔器打取5 mm 的圓形菌餅若干，將菌餅小心的貼合在健康無(wú)病害、長(zhǎng)勢(shì)一致的聊紅椿幼苗葉片上，每棵幼苗選取3 個(gè)葉片處理，同時(shí)放置空白PDA 菌餅的葉片作為對(duì)照，每組3 棵重復(fù)。貼合完用透明袋遮住整棵幼苗，放到25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，每天記錄觀察幼苗發(fā)病情況并拍照。對(duì)出現(xiàn)病斑葉片的幼苗，觀察其發(fā)病癥狀是否與接種植物的癥狀一致，并再次從病葉上病健交界分離純化致病菌，與從大田分離到的病原菌進(jìn)行對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 聊紅椿葉部病害田間癥狀

對(duì)聊城大學(xué)生態(tài)園中的聊紅椿葉部病害進(jìn)行了田間癥狀觀察，發(fā)現(xiàn)炭疽病是其重要病害之一，主要為害葉片。發(fā)病初期葉片顏色由綠轉(zhuǎn)為紅色，在葉尖及葉緣形成大小不同的褐色病斑，呈不規(guī)則形狀，如病情較重則葉部病斑極易碎裂、脫落，形成穿孔癥狀（見(jiàn)圖1）。病害也易造成葉片提早脫落，影響樹(shù)勢(shì)。

圖1 聊紅椿葉部病害的田間癥狀特征

2.2 病原菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

采用組織分離法分離聊紅椿葉部病害病原菌[19]，得到多個(gè)病原菌株，其中A2 菌株從菌落形態(tài)初步判定屬于炭疽病菌，菌株在28 ℃條件下生長(zhǎng)良好，產(chǎn)生白色菌絲，向四周輻射狀生長(zhǎng)（見(jiàn)圖2a），隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，慢慢形成圓形菌落，經(jīng)7～8 d 長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿（見(jiàn)圖2b）。

圖2 菌株A2形態(tài)特征

初期菌絲為白色絮狀，菌絲絨毛狀茂盛濃密，菌落邊緣光滑規(guī)則。培養(yǎng)15 d 后菌落顏色變暗，形成橘紅色的團(tuán)狀物質(zhì)，這就是病原菌的分生孢子梗與分生孢子（見(jiàn)圖2c）；在顯微鏡下檢測(cè)觀察到菌絲有隔，分生孢子是長(zhǎng)橢圓形單胞，兩端鈍圓（見(jiàn)圖2d）。

2.3 病原菌的分子學(xué)鑒定

采用DNA提取試劑盒提取菌株的DNA，利用引物ITS4/ITS5 對(duì)真菌的DNA 擴(kuò)增rDNA-ITS 序列，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳可檢測(cè)到清晰的條帶，菌株A2 的rDNA-ITS 序列大小在600 bp 左右條帶（見(jiàn)圖3），符合進(jìn)一步的測(cè)序條件。

圖3 菌株A2的rDNA-ITS擴(kuò)增片段電泳

經(jīng)過(guò)測(cè)序得到了A2 菌株的ITS 序列，將獲得的ITS 序列在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST，將菌株A2 的相應(yīng)序列與所得到的同源性較高的部分序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖4 所示，菌株A2 的rDNA-ITS序列與暹羅刺盤(pán)孢（登陸號(hào)：MW322808.1）同源性最高，達(dá)到100%，結(jié)合菌株A2的各種形態(tài)分析結(jié)果，綜合鑒定致病菌A2是暹羅刺盤(pán)孢。

圖4 菌株A2的rDNA-ITS序列構(gòu)建的發(fā)育樹(shù)

2.4 病原菌的致病性鑒定

將分離到的暹羅刺盤(pán)孢菌餅放置到聊紅椿健康葉片4 d 后（見(jiàn)圖5a），病斑開(kāi)始在葉片與菌餅接觸的邊緣長(zhǎng)出。接種7 d后將菌餅去除（見(jiàn)圖5b、圖5c），病斑清晰可見(jiàn)，隨著侵染時(shí)間增加，病斑面積逐漸擴(kuò)大，對(duì)比田間癥狀發(fā)現(xiàn)生成的病害癥狀特點(diǎn)和聊紅椿炭疽病病情一致，表明暹羅刺盤(pán)孢是聊紅椿炭疽病的病原菌。

圖5 暹羅刺盤(pán)孢菌致病性測(cè)定

3 結(jié)論與討論

紅果臭椿作為臭椿中的一個(gè)新品種，適應(yīng)性好、樹(shù)形美觀，每年夏季果實(shí)紅艷讓人賞心悅目，觀賞價(jià)值很高，極具市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景，是庭院綠化和街道美化的良好樹(shù)種[20-24]。但是在聊城大學(xué)生態(tài)園觀察到聊紅椿葉片在多雨季節(jié)易于感染葉部病害，產(chǎn)生病斑，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致葉片脫落，影響樹(shù)木的生長(zhǎng)與觀賞性[25]，值得深入研究，本研究通過(guò)對(duì)葉部病害病原菌的分離鑒定初步確定為炭疽病。

炭疽病是一種重要的真菌病害，寄主范圍廣，對(duì)植物的危害很大，已在多種植物上報(bào)道了炭疽病，例如山藥炭疽病[26]、葡萄炭疽病[27]、廣西油茶炭疽病[28]、芒果炭疽病[29]等。暹羅刺盤(pán)孢是炭疽病病原菌的一種，暹羅刺盤(pán)孢引起的植物炭疽病也已有報(bào)道，例如曹雪仁等對(duì)海南橡膠樹(shù)暹羅刺盤(pán)孢菌遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析[30]；徐丹丹等從美麗崖豆藤分離鑒定了暹羅刺盤(pán)孢菌[31]；李河等鑒定到油茶炭疽病是由暹羅刺盤(pán)孢菌引起的[32]。炭疽病是一種真菌，對(duì)真菌的分離鑒定一般是通過(guò)病原菌分離形態(tài)學(xué)觀察[33-34]、致病性鑒定[35]、分子生物性鑒定[36]等途徑來(lái)確定，特別是對(duì)于近似種較多的炭疽菌需要結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)來(lái)進(jìn)行區(qū)別鑒定。

本研究通過(guò)病原菌分離與形態(tài)學(xué)鑒定，觀察到菌絲為白色絮狀，菌絲絨毛狀茂盛濃密，菌落邊緣光滑規(guī)則，后期形成橘紅色的團(tuán)狀物質(zhì)，分生孢子是長(zhǎng)橢圓形單胞，兩端鈍圓，與李文等描述的百日草炭疽病菌特征相似，初步確定為炭疽病[37]。經(jīng)致病性測(cè)定和分子生物學(xué)鑒定，菌株A2 的rDNA-ITS 序列與暹羅刺盤(pán)孢（登陸號(hào)：MW322808.1）同源性達(dá)到100%，最終確定引起聊紅椿炭疽病的病原菌是暹羅刺盤(pán)孢菌。本研究結(jié)果為聊紅椿炭疽病的防治和新品種快速推廣奠定了基礎(chǔ)。