陳琳，陳清宙，史景莉，戴豫宛，崔翠云，燕備戰(zhàn)

1.河南省人民醫(yī)院輸血科鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003；

2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450052

ABO血型系統(tǒng)在臨床輸血中有重要意義，血型包括A、B、O、AB四型，由第9號染色體上的ABO等位基因和H基因控制A、B、O抗原的合成，基因的多態(tài)性主要集中在第6、第7 外顯子，是由于其占編碼區(qū)的大部分，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性區(qū)域[1-2]。遺傳、感染、物理、化學(xué)等因素可引起ABO等位基因突變，使編碼的A、B抗原減弱或消失[3]?；蛲蛔円鸬囊呻y血型造成臨床上患者的血型鑒定和輸血困難，血清學(xué)技術(shù)不能鑒定的血型需采用基因檢測技術(shù)，目前常用的血型基因檢測方法如序列特異性引物PCR-SSP 法和Sanger 測序法[4]。AB 型含有A、B 兩種抗原，基因突變引起的等位基因多樣，有關(guān)AB 兩種亞型B(A)、CisAB 的報道較多，其中B(A)、CisAB 屬于順式遺傳，A、B 等位基因在同一條DNA 鏈上，關(guān)于其他亞型的報道較少[5-6]。本研究旨在通過基因檢測技術(shù)探索AB其他亞型，為血型鑒定和安全輸血提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021—2022 年間河南省人民醫(yī)院ABO、RhD血型鑒定卡式法抗A或抗B凝集強(qiáng)度≤2+，即A或B抗原表達(dá)減弱的AB型疑難血型，血清學(xué)實驗正定型實驗A或B抗原減弱甚至消失，反定型實驗為AB型。收集到的8例標(biāo)本編號為1～8。

1.2 試劑與儀器 ABO 反定型紅細(xì)胞試劑盒購自北京金豪制藥股份有限公司，達(dá)亞美ABO 正反定型、RhD 血型檢測卡購自美國伯樂公司，熒光PCR 法人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒和ABO外顯子測序試劑盒購自江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司。IH-1000全自動血型分析儀來自美國BIO-RAD公司,PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 血型的血清學(xué)實驗方法 血型鑒定采用微柱凝膠卡式法，包括正定型實驗、反定型實驗和RhD 血型鑒定。對于抗原消失的標(biāo)本還需要做吸收放散實驗確定有無A 或B 抗原，方法為將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌5遍后加入抗血清，4℃放置1～2 h，間斷震蕩混勻，后將紅細(xì)胞洗滌干凈，置于56℃樣品孵育器進(jìn)行放散實驗，放散結(jié)束迅速離心收集放散液檢測A、B抗原。

1.3.2 血型鑒定的基因檢測

1.3.2.1 PCR-SSP 法基因檢測 ABO 基因分型(PCR-SSP 法)采用人類紅細(xì)胞ABO 血型基因分型試劑盒，該試劑盒用于檢測人類紅細(xì)胞基因組DNA 中ABO 血型的等位基因，包括A、A205、B、OT、O1、O2等，根據(jù)反應(yīng)格局判定檢測標(biāo)本的基因型。實驗委托江陰衛(wèi)健委血型基因檢測聯(lián)合參比實驗室，實驗過程包括：(1)樣本DNA 的提?。?2) PCR 擴(kuò)增等位基因；(3)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：采用3%的瓊脂糖凝膠電泳法，每孔加入5 μL 樣品，0.5×TBE 緩沖液中電泳30 min，產(chǎn)物條帶與已知條帶大小的DNA marker進(jìn)行比較。

1.3.2.2 Sanger 測序基因檢測 Sanger 測序采用ABO外顯子測序試劑盒，也由江陰實驗室依據(jù)試劑盒說明書操作，實驗過程為：1、DNA樣本的提取；2、選用特異性引物，擴(kuò)增ABO 等位基因外顯子；3、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序。通過PCR法對第1～7外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，將測序結(jié)果與ABO等位基因數(shù)據(jù)庫ISBT、BGMUT 等比對分析判定其ABO基因分型。

2 結(jié)果

2.1 血型鑒定的血清學(xué)實驗結(jié)果 本實驗共收集了8例抗原減弱或丟失標(biāo)本，血清學(xué)實驗結(jié)果如表1所示，除3 號標(biāo)本，其他7 個標(biāo)本經(jīng)微住凝膠卡檢測后，正定型實驗均能檢測到A、B 抗原，但A 抗原或B抗原表達(dá)減弱，反定型實驗均為AB型。3號標(biāo)本進(jìn)行B 抗原的吸收放散實驗后，檢測出B 抗原。依據(jù)血清學(xué)實驗結(jié)果，正定型實驗雖都存在A、B 抗原，反定型實驗為AB 型，但僅依據(jù)血清學(xué)結(jié)果不能判定血型為AB型，也可能是亞型，需進(jìn)一步結(jié)合基因檢測結(jié)果綜合判定血型。

表1 血型鑒定的血清學(xué)結(jié)果Table 1 Serological results of blood group identification

2.2 血型PCR-SSP 基因分型結(jié)果 經(jīng)人類紅細(xì)胞ABO 基因分型試劑盒檢測，結(jié)果如表2 所示，8個標(biāo)本均表現(xiàn)為等位基因A、B 陽性，等位基因A205、OT、O1、O2 為陰性，基因分型結(jié)果判定血型均為AB 型。

表2 ABO等位基因PCR-SSP法分型結(jié)果Table 2 Results of ABO allele PCR-SSP typing

2.3 血型Sanger測序結(jié)果

2.3.1 血型Sanger 測序的基因型 首先應(yīng)用外顯子檢測試劑盒對8 個標(biāo)本的第1～7 外顯子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果依據(jù)來自于國際輸血學(xué)會(ISBT)數(shù)據(jù)、血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫(BGMUT)、文獻(xiàn)報道等，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析。測序基因型如表3 所示。8 個A或B 抗原減弱的標(biāo)本共表現(xiàn)為4 個基因型，1 號標(biāo)本基因型為A1.01/B.01，2 號標(biāo)本基因型為A1.02/BW.07，3.4 號標(biāo)本基因型為A1.02/BW.12，5、6、7、8 號標(biāo)本基因型為A1.02/B.01。

表3 血型Sanger測序基因型Table 3 Sanger sequencing genotype of blood type

2.3.2 血型Sanger測序的突變位點

2.3.2.1 共有突變位點 8 例標(biāo)本以A1.01 做為參考序列，ABO等位基因測序有7 個共同的突變位點(表4)，分別為Exon6：c.297A＞G，Exon7：c.526C＞G，c657C＞T，c.703G＞A，c.796C＞A，c803G＞C，c930G＞A，外顯子6上有1個同義突變位點，外顯子7上有6 個突變位點，既有同義突變又有錯義突變，堿基的同義突變不改變編碼的氨基酸，錯義突變改變編碼的氨基酸。第7 外顯子堿基c.526C＞G 的突變導(dǎo)致精氨酸變?yōu)楦拾彼?，c.703G＞A 堿基的突變使甘氨酸變成絲氨酸，c.796C＞A 堿基的突變引起亮氨酸變?yōu)榧琢虬彼?，c803G＞C堿基的突變使編碼的甘氨酸變?yōu)楸彼帷?/p>

表4 Sanger測序7個共同的突變位點Table 4 Seven common mutation sites of Sanger sequencing

2.3.2.2 特異性突變位點 其他7 例標(biāo)本與A1.01/B.01 相比，A1.02/B.01 基因型特異性突變位點位于第7 外顯子為c.467C＞T，A1.02/BW.07 基因型特異性突變位點位于第7 外顯子為c.467C＞T、c.1055G＞A。A1.02/BW.12 基因型特異性突變位點分別位于第6和第7外顯子為c.278C＞T、c.467C＞T。c.278C＞T 和c.467C＞T 即外顯子第278 位、467 位胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏ぃ幋a的第93 位、156 位氨基酸由脯氨酸變成亮氨酸；c.1055G＞A 為第1 055 位鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰剩幋a的352 位氨基酸由精氨酸變成谷氨酰胺。特異性突變位點的突變類型均為錯義突變，基因型為雜合。

2.3.3 亞型標(biāo)志性突變點 ABO 等位基因外顯子測序后對亞型標(biāo)志性突變位點截圖，與A1.02/B.01相比(圖1)，A1.02/BW.07 亞型的標(biāo)志性突變位點為1055G＞A，密碼子CGG 突變?yōu)镃AG，編碼的氨基酸發(fā)生表5 中的變化。A1.02/BW.12 亞型的標(biāo)志性突變(圖2)為278C＞T，密碼子由CCC 變?yōu)镃TC，編碼的氨基酸發(fā)生表5中的改變。

圖1 A1.02/Bw.07亞型標(biāo)志性突變點Figure 1 Marked mutation point of A1.02/Bw.07 subtype

圖2 A1.02/Bw.12亞型標(biāo)志性突變點Figure 2 Marked mutation point of A1.02/Bw.12 subtype

表5 Sanger測序特異性突變位點Table 5 Specific mutation sites of Sanger sequencing

3 討論

據(jù)報道中國人群中A1.02 基因的表達(dá)比A1.01 基因的表達(dá)高，是A 基因型中高表達(dá)的等位基因，且A1.02 翻譯糖基轉(zhuǎn)移酶的活力與A1.01 相比無明顯差異[7]。本研究發(fā)現(xiàn)8 例標(biāo)本中也是A1.02 等位基因常見，與前學(xué)者的研究相一致，A 等位基因有1 例為A1.01，A 抗原凝集強(qiáng)度4+，其余7 例均為A1.02，A 抗原的凝集強(qiáng)度2+～4+。在中國人群中，B101是亞洲人常見的B 等位基因[8]。本研究8 例標(biāo)本中也是B.01 等位基因常見，B 等位基因有三種，分別為B.01、Bw07、Bw12，5例標(biāo)本B基因型為B.01等位基因，B抗原凝集強(qiáng)度2+～4+，1 例標(biāo)本B 基因型為Bw.07 等位基因，血清學(xué)B 抗原凝集強(qiáng)度1+，2 例標(biāo)本B 基因型為Bw.12等位基因，血清學(xué)B抗原凝集強(qiáng)度分別為陰性(吸收放散實驗B抗原陽性)、1+。本研究8例標(biāo)本的血清學(xué)格局顯示不同的等位基因編碼的血型抗原，其血清學(xué)表型可相同，即使同一種ABO 等位基因編碼的血型抗原，在不同個體其血清學(xué)凝集強(qiáng)度也可不同。血型抗原的凝集強(qiáng)度除了與疾病或編碼區(qū)外顯子的基因突變有關(guān)，還與啟動子、內(nèi)含子等非編碼調(diào)控區(qū)域的基因突變有關(guān)[9-11]。

在無錫地區(qū)獻(xiàn)血者ABO 亞型研究中，張震等[12]發(fā)現(xiàn)B 亞型多于A 亞型，ABO 等位基因的多樣性決定了ABO 亞型的多樣性。何保仁等[13]研究報道，在南寧地區(qū)獻(xiàn)血員中發(fā)現(xiàn)AB亞型10 例，基因型分別為A101Bw11(4 例)、A102Bw11(1 例)、A102B108(1 例)、A102/B101(4 例)，A102/B101 基因型A 抗原的凝集強(qiáng)度為2+，吸收放散實驗A抗原凝集強(qiáng)度為3+。黃惠妮等人在ABO疑難血型的基因檢測中報道了4例AB亞型，分 別 為A102/Bw11、A102/Bw12、A102/B303、A102/B101[14]。通過基因檢測發(fā)現(xiàn)本實驗室四種AB亞 型，分 別 為A1.01/B.01 (1 例)、A1.02/B.01 (4 例)、A1.02/BW.07 (1 例)、A1.02/ABO*BW.12 (2 例)。由上可推測不同地區(qū)人群AB亞型的基因型不全相同。

本研究中的A1.02/B.01 與A1.01/B.01 比較，突變位點在A1.02 等位基因第467 位，胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?T)，編碼的第156 位氨基酸由脯氨酸(Pro)變成亮氨酸(Leu)。與賈雯婷等人研究中提到的A2等位基因突變位點一致[15]。Bw基因型，w為weak 的縮寫，顧名思義該基因型的B 抗原表達(dá)較弱，可能是由于Bw基因影響α糖基轉(zhuǎn)移酶的活性所致[16-17]。Bw07 等位基因為第1 055 位鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，編碼的氨基酸由精氨酸(Arg)變成谷氨酰胺(Gln)。與文獻(xiàn)報道的ABw07 型突變位點一致，反定型B 細(xì)胞發(fā)生弱凝集[18-19]。本研究2 號ABw07 型并未發(fā)現(xiàn)反定型B 細(xì)胞凝集，說明ABO 亞型即使基因分型相同，亞型血清中抗體也可能不同，有待進(jìn)一步探究是否與疾病或非編碼區(qū)基因突變有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Bw12 等位基因由于第278 位胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?T)產(chǎn)生，編碼的脯氨酸(Pro)變成亮氨酸(Leu)。與陳靜思等[20]研究中報道的Bw12 等位基因突變位點一致，均引起B(yǎng)抗原的表達(dá)減弱。標(biāo)本3 中Bw12 等位基因甚至引起B(yǎng) 抗原丟失，吸收放散實驗方能檢測到B 抗原?；蛲蛔兂Ｒ鹛腔D(zhuǎn)移酶活性下降，使編碼的抗原表達(dá)減弱[21]。

對于正反定型一致抗原減弱的AB 亞型，可以選擇輸注AB 紅細(xì)胞或O 洗滌紅細(xì)胞，若正反定型不一致抗原減弱AB亞型，可輸O型洗滌紅，非紅細(xì)胞成分可輸注AB 型血漿、冷沉淀或血小板。近年來基因檢測技術(shù)被廣泛用來檢測疑難血型，從分子層面揭示疑難血型產(chǎn)生的本質(zhì)是基因突變?nèi)鐔魏塑账嵬蛔?、堿基缺失等[12]。對于疑難血型僅通過血清學(xué)技術(shù)易導(dǎo)致血型的誤判，將血清學(xué)技術(shù)與基因檢測技術(shù)相結(jié)合，才能準(zhǔn)確鑒定血型，保證輸血安全[22]。