馬 遠(yuǎn) 唐 丹 孫克偉

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科 (湖南 長(zhǎng)沙, 410208)

慢加急性肝衰竭(ACLF)是在慢性肝病基礎(chǔ)上發(fā)生的、以急劇肝功能失代償、器官功能衰竭和高短期死亡率為特征的臨床癥候群[1]。HBV相關(guān)ACLF(HBV-ACLF)是我國(guó)肝衰竭最常見(jiàn)的類型,占所有肝衰竭的80%以上[2]。肝移植被認(rèn)為是目前最有效的治療手段,但肝源緊張,治療費(fèi)用高昂,無(wú)法有效地開(kāi)展應(yīng)用[3]。HBV-ACLF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為免疫損傷和炎癥反應(yīng)在其發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁,是唯一能激活初始T淋巴細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞,在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。以DCs-T淋巴細(xì)胞軸為中心的細(xì)胞免疫功能低下是 HBV持續(xù)感染、引發(fā)肝炎重癥化的重要原因[4]。

中醫(yī)藥治療HBV-ACLF多從黃疸辨證,傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為陽(yáng)黃證禁用溫法。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF患者多有肝硬化的基礎(chǔ)、病程長(zhǎng)、苦寒藥應(yīng)用多,從病機(jī)到臨床均有脾虛表現(xiàn),因此提出ACLF陰黃化的傾向和早期溫法干預(yù)理論[5,6]。溫陽(yáng)解毒化瘀方是我院協(xié)定處方,治療肝衰竭療效確切[7,8]。本研究擬運(yùn)用HBV-ACLF陽(yáng)黃證患者DCs體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型和中藥血清藥理實(shí)驗(yàn)方法,比較溫法(溫陽(yáng)解毒化瘀)方含藥血清和去溫法(溫陽(yáng)解毒化瘀減白術(shù)、附片方)含藥血清對(duì)HBV-ACLF陽(yáng)黃證患者DCs功能的影響,為溫法早期臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠42只,雌雄各半,8～9周齡,體質(zhì)量180～200 g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004,飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)嚴(yán)格經(jīng)過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查,動(dòng)物倫理審批編號(hào)LLBH-202010220001。

1.2 藥物與試劑 中藥飲片茵陳、丹參、赤芍、薏苡仁、附片、白術(shù)購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,由鄧桂明副主任藥師鑒定符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》要求。胎牛血清(FBS,美國(guó)Gibco公司),RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?,CD14磁珠(德國(guó)Miltenyi Biotec公司),人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)、人白細(xì)胞介素(hIL-4)(美國(guó)Pepro Tech公司),CD11C、HLA-DR、CD80、CD83、CD86抗體(美國(guó)BD公司),聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly(I∶C)(美國(guó)sigma公司),絲裂霉素C(Biovision公司),人IL-12、IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)試劑盒 (上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.3 儀器 生物安全柜及二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Electron公司);5810R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);XD-202型倒置生物顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司);磁珠分選儀(德國(guó)Miltenyi Biotec公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.4 方法

1.4.1 DCs細(xì)胞分離、培養(yǎng)及純度鑒定 選擇2020年9月至2021年5月我院住院的HBV-ACLF陽(yáng)黃證患者8例,男7例,女1例,平均年齡(34.8±9.6)歲。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《肝衰竭診治指南(2018年版)》[9]。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)國(guó)家診斷標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)》及王永炎主編《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》中有關(guān)黃疸陽(yáng)黃證的中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn),陽(yáng)黃證：主癥：①身目俱黃,黃色鮮明;②舌質(zhì)紅或紅絳,或兼見(jiàn)瘀斑瘀點(diǎn),舌苔黃膩;③脈實(shí)有力或滑數(shù)。次癥：①口干口苦,或見(jiàn)惡心嘔吐;②大便秘結(jié);③鼻齒衄血,或皮膚瘀斑;④小便短少黃赤。辨證要求為符合主證3項(xiàng),或主證2項(xiàng)加次證2項(xiàng)。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)審批,所有患者均簽署知情同意書。另選取8名健康對(duì)照者,男7例,女1例,平均年齡(32.8±8.1)歲。依照文獻(xiàn)方法分離培養(yǎng)DCs,無(wú)菌采集患者及健康對(duì)照者外周血20 ml,分離后獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),洗滌離心后,按1×107個(gè)細(xì)胞用80 μl磁珠Buffer和20 μl CD14免疫磁珠重懸細(xì)胞,4℃孵育15 min,經(jīng)磁珠分選儀分選出CD14單核細(xì)胞,按5×105/ml置于24孔板中,用含10% FBS、hGM-CSF 1 000 U/ml、hIL-4 500 U/ml的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中,隔天半量換液,并補(bǔ)足細(xì)胞因子(初始劑量的1/2),培養(yǎng)第5天加入50 μg/ml Poly(I∶C)培養(yǎng)48 h,獲得成熟的樹(shù)突細(xì)胞(mDC)。觀察細(xì)胞形態(tài)變化,同時(shí)用流式管收集DCs,加入FITC-抗人CD11C、APC-Cy7-抗人HLA-DR在4℃冰箱孵育30 min,予以PBS洗滌1遍,加入100 μl PBS重懸后置于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.4.2 含藥血清的制備 將溫陽(yáng)解毒化瘀方：茵陳、丹參、白術(shù)、薏苡仁各30 g,赤芍60 g,附片10 g(溫法)與溫陽(yáng)解毒化瘀方減附子、白術(shù)方：茵陳 、丹參 、薏苡仁各30 g,赤芍 60 g(去溫法)分別加10倍量純水浸泡30 min,加熱煮沸,文火煎煮1 h,趁熱濾過(guò);再按同法再煎煮1次,合并2次濾液,并分別濃縮兩方提取液。將42只SD大鼠隨機(jī)分為6組：空白組,生理鹽水組,溫法高、低劑量組及去溫法高、低劑量組,每組7只。〗根據(jù)人大鼠體表面積比值折算本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常灌胃劑量為人體服用劑量的6.3倍,溫法低劑量組大鼠給藥量為17.1 g·kg-1·d-1;溫法高劑量組大鼠給藥量為34.2 g·Kg-1·d-1;去溫法低劑量組大鼠給藥量為13.5 g·kg-1·d-1,去溫法高劑量組大鼠給藥量為27.0 g·Kg-1·d-1;空白組大鼠不進(jìn)行灌胃;生理鹽水組大鼠灌胃等體積生理鹽水,給藥量為10 ml·kg-1,2次/d,連續(xù)5 d,末次給藥1 h后,水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈采血,4℃ 3 000 r/min離心15 min分離血清,56℃水浴滅活30 min,0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌分裝,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 最佳含藥血清濃度的確定 收集培養(yǎng)成熟的DCs細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基配制成單細(xì)胞懸液,以6×105/ml接種96孔培養(yǎng)板,每孔100 μl,細(xì)胞貼壁過(guò)夜后,將原培養(yǎng)基吸出,加入5%、10%、20%含藥血清及空白血清,每一濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,5% CO2、37℃培養(yǎng)24、48、72 h后,每孔加入10 μl CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)定吸光度(A)。

1.5 DCs細(xì)胞分組 根據(jù)CCK-8篩選最佳含藥血清結(jié)果,將兩組人員的DCs細(xì)胞分為5組,正常組(10%FBS 1640培養(yǎng)基+健康對(duì)照組人員DCs)、模型組(10% FBS 1640培養(yǎng)基+HBV-ACLF陽(yáng)黃證患者DCs)、溫法干預(yù)組(10%溫法高劑量含藥血清1640培養(yǎng)基+HBV-ACLF陽(yáng)黃證患者DCs)、去溫法干預(yù)組(10%去溫法高劑量含藥血清1640培養(yǎng)基+HBV-ACLF陽(yáng)黃證患者DCs )、空白組(空白血清 1640培養(yǎng)基+HBV-ACLF陽(yáng)黃證患者DCs)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表面HLA-DR、CD80、CD86、CD83表達(dá)及平均熒光強(qiáng)度(MFI) 將各組DCs分別加入標(biāo)記APC-Cy7-抗人HLA-DR,PE-Cy7抗人CD80,APC-抗人CD86,PE-抗人CD83的熒光抗體,避光30 min。用含有1% FBS的PBS洗滌,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 ELISA檢測(cè)DCs分泌IL-12、IL-6、IL-10水平 收集各組DCs上清液,按照人IL-12、IL-6、IL-10檢測(cè)試劑盒說(shuō)明加樣,于450 nm處檢測(cè)A值,以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程計(jì)算IL-12、IL-6、IL-10含量。

1.8 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR) 無(wú)菌條件下采集對(duì)照組人員外周血10 ml,分離PBMC,經(jīng)磁珠分選系統(tǒng)陰選后獲得T細(xì)胞,以完全培養(yǎng)基懸浮,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml,注入96孔板,每孔100 μl,同時(shí)收集各組干預(yù)后的DCs用50 μg/ml的絲裂霉素C 37℃處理45 min后,PBS洗滌2次,懸浮于完全RPMI 1640培養(yǎng)基中,分別以1∶10、1∶20的比例加入96孔培養(yǎng)板,終體積200 μl/孔,每組各3個(gè)復(fù)孔,對(duì)照孔不加DCs,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h后,離心去上清液,每孔加入100 μl完全培養(yǎng)基,10 μl CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)各孔A值。

2 結(jié)果

2.1 DCs體外培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞鑒定 磁珠分選CD14+細(xì)胞,加入hGM-CSF、hIL-4刺激,培養(yǎng)第1天,細(xì)胞未見(jiàn)明顯突起,第3天可見(jiàn)細(xì)胞增殖集落形成,少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)少許突起,第5天,可見(jiàn)大量細(xì)胞懸浮或半懸浮,細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài),第7天細(xì)胞突出更加明顯,呈典型的樹(shù)突狀形態(tài),見(jiàn)圖1。選擇CD11C、HLA-DR作為DCs的標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC的純度達(dá)96.4%,見(jiàn)圖2。

圖1 倒置顯微鏡下DCs形態(tài)特征 (×200) A、B、C、D代表培養(yǎng)第1、3、5、7天DCs形態(tài)

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定DCs及純度分析 A：去粘連;B：標(biāo)死活;C：DC純度

2.2 最佳含藥血清濃度篩選 與空白組DCs同期比較,溫法高劑量組DCs與去溫法高劑量組DCs吸光度(A)24 h、48 h明顯升高,72 h下降,表明溫法高劑量藥物血清與去溫法高劑量藥物血清在24 h、48 h對(duì)DCs有促增殖作用,72 h增殖作用減弱,24 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),各質(zhì)量濃度含藥血清對(duì)DCs的增殖作用在培養(yǎng)48 h時(shí)最強(qiáng),見(jiàn)表1。結(jié)合文獻(xiàn)和課題組前期研究[10],故本實(shí)驗(yàn)選擇溫法、去溫法高劑量含藥血清作為最佳的含藥血清濃度,最佳作用時(shí)間選擇48 h。

表1 不同質(zhì)量濃度含藥血清在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)DCs增殖的影響

2.3 不同劑量含藥血清對(duì)DCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR表達(dá)的影響 與正常組比較,模型組DCs的CD80、CD86、CD83、HLA-DR表達(dá)率明顯降低(P<0.01);與模型組比較,溫法干預(yù)組DCs的CD80、CD86、CD83、HLA-DR表達(dá)率明顯升高(P<0.05),其中CD83,HLA-DR變化顯著(P<0.01);空白組較模型組DCs的CD83,HLA-DR表達(dá)率稍增高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);去溫法干預(yù)組DCs的CD80、CD86、CD83、HLA-DR表達(dá)率較模型組升高,但CD80、CD86、CD83表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HLA-DR升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3和表2。

表2 各組DCs的CD80、CD86、CD83、HLA-DR表達(dá)率比較

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組DC表達(dá)CD80、CD86、CD83、HLA-DR圖 A：正常組;B：模型組;C：空白組;D：溫法干預(yù)組;E：去溫法干預(yù)組

各組DCs的CD80、CD86、CD83、HLA-DR平均熒光強(qiáng)度(MFI)結(jié)果：與正常組比較,模型組DCs的CD80、CD86、CD83,HLA-DR MFI明顯降低(P<0.01);與模型組比較,溫法干預(yù)組DCs的CD80、CD86、CD83、HLA-DR MFI明顯升高(P<0.01);空白組與模型組DCs的CD80、CD86、CD83、HLA-DR MFI比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);去溫法干預(yù)組DCs的CD80、CD86、CD83 MFI值較模型組升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HLA-DR MFI升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 各組DCs的CD80、CD86、CD83、HLA-DR平均熒光強(qiáng)度

2.4 各組DCs分泌細(xì)胞因子 IL-12、IL-6、IL-10情況 與正常組比較,模型組DCs分泌細(xì)胞因子 IL-12、IL-10明顯降低(P<0.01),IL-6明顯升高(P<0.01);與模型組比較,溫法干預(yù)組DCs 分泌細(xì)胞因子 IL-12、IL-10明顯升高(P<0.01),IL-6明顯降低(P<0.01);去溫法干預(yù)組DCs 分泌細(xì)胞因子 IL-12、IL-10升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),IL-6明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 各組DCs分泌細(xì)胞因子IL-12、IL-6、IL-10水平比較

2.5 各組DCs對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響 與正常組比較,模型組DCs與T淋巴細(xì)胞在1∶10、1∶20共培養(yǎng)水平下,均出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞增殖能力降低(P<0.01);與模型組比較,溫法干預(yù)組DCs促T淋巴細(xì)胞增殖能力顯著提高(P<0.01),空白組與去溫法干預(yù)組DCs促T淋巴細(xì)胞增殖能力稍升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組DCs促T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)比較

3 討論

HBV-ACLF多發(fā)生于慢性乙型肝炎、肝硬化基礎(chǔ)上,因病毒復(fù)制導(dǎo)致的免疫功能損傷是始動(dòng)因素,免疫損傷直接或間接導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死,介導(dǎo)局部炎癥,進(jìn)一步加重肝損傷,導(dǎo)致肝臟代謝功能紊亂,誘發(fā)或加重肝外多臟器功能衰竭。免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的肝功能損傷是HBV-ACLF發(fā)病的首要機(jī)制,DCs作為最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞,在先天免疫和獲得性免疫中發(fā)揮關(guān)鍵性作用,它的免疫狀態(tài)直接影響機(jī)體的免疫應(yīng)答。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF患者外周血DCs數(shù)量明顯減少,存活組患者DCs絕對(duì)數(shù)明顯高于死亡組,DCs可作為影響患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)肝衰竭不同證型、不同階段的患者均存在DCs功能低下,疾病進(jìn)展與DCs功能低下呈正相關(guān),因此調(diào)控DCs在HBV-ACLF治療中有重要意義。

中醫(yī)藥治療HBV-ACLF療效確切,多從黃疸辨證論治,分為陽(yáng)黃與陰黃,傳統(tǒng)觀念認(rèn)為陽(yáng)黃禁用溫法,以防溫陽(yáng)化火而加重黃疸。前期研究發(fā)現(xiàn) ACLF發(fā)病過(guò)程中始終存在濕熱、瘀熱、脾虛3個(gè)因素,在疾病的不同階段,各因素表現(xiàn)主次可不同,但脾虛始終存在,ACLF黃疸辨證論治可早期加溫藥干預(yù)[12]。溫陽(yáng)解毒化瘀方是我院協(xié)定處方,由附子、赤芍、白術(shù)、薏苡仁、茵陳、丹參等六味藥組成,具有清熱利濕、溫陽(yáng)健脾、活血化瘀的作用,治療肝衰竭療效顯著。本研究通過(guò)比較溫陽(yáng)解毒化瘀方(溫法)含藥血清與溫陽(yáng)解毒化瘀方減附片、白術(shù)方(去溫法)含藥血清對(duì)HBV-ACLF陽(yáng)黃證患者DCs功能的影響,不僅有利于進(jìn)一步明確HBV-ACLF陰黃化的發(fā)病機(jī)制,同時(shí)也為早期溫法治療HBV-ACLF的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

因DCs僅占PBMC 的0.1%～1%,不利于功能研究,因此本實(shí)驗(yàn)采用單核細(xì)胞衍生的DCs體外模型進(jìn)行研究[13],利用磁珠分選方法,從PBMC中分離CD14+單核細(xì)胞,誘導(dǎo)培養(yǎng)成成熟DCs后經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定和純度分析[14],采用CD11C和HLA-DR分子作為鑒定指標(biāo),經(jīng)鑒定細(xì)胞純度在80%以上,可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CD83是DCs成熟的相對(duì)特異性標(biāo)志。DCs成熟后高表達(dá)HLA-Ⅱ類分子和共刺激分子(CD80、CD86),協(xié)同作用,激活初始T淋巴細(xì)胞。去溫法干預(yù)組DCs的HLA-DR升高,但CD80,CD86升高不明顯,不能有效激活T細(xì)胞。成熟的DC分泌IL-12,促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化,有助于提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能,有效清除HBV病毒。IL-6和IL-10是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì),活化的DC分泌IL-6,聯(lián)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β),促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th17分化;而IL-10聯(lián)合TGF-β促進(jìn)Th0細(xì)胞向Treg分化,前期研究發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF患者存在Th17/Treg失衡[15],可能與DCs功能低下相關(guān),進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證溫陽(yáng)解毒化瘀方可調(diào)控Th17/Treg失衡[16],與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符。

溫法干預(yù)可明顯提高HBV-ACLF陽(yáng)黃證患者外周血DCs功能,有利于HBV病毒的清除和免疫功能紊亂的恢復(fù),可能是溫法作用的潛在機(jī)制,為溫法的早期臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因HBV-ACLF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,機(jī)體存在嚴(yán)重免疫細(xì)胞功能紊亂和促炎、抑炎因子分泌失衡,DCs功能在疾病不同時(shí)期會(huì)受到不同程度的影響。因本實(shí)驗(yàn)樣本量有限,所得到的結(jié)果可能未能全面地反應(yīng)疾病整個(gè)病程,有待今后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。