尹瑞英 魏飛力 胡建華

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合中心 (北京, 100069) 2.北京市肝病研究所

急性肝衰竭(ALF)是肝細胞急性損傷的嚴重后果,可在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)演變?yōu)橹旅Y(jié)果。ALF的5個最普遍的原因是對乙酰氨基酚(APAP)過量、病毒性肝炎、藥物性肝損傷、威爾遜病和自身免疫性肝炎[1]。ALF患者的管理包括一般考慮、病因特異性管理、給藥緩解肝功能衰竭、急性肝功能衰竭的系統(tǒng)性并發(fā)癥管理和肝移植[2]。ALF的治療選擇很少,但研究表明,當懷疑服用對乙酰氨基酚過量時,早期服用乙酰半胱氨酸可能會保護肝臟免受損傷[3]。然而,這種干預(yù)僅部分有效,并伴有不良反應(yīng),包括過敏性反應(yīng)[4]。因此,對于急性肝功能衰竭患者,有必要尋找其他干預(yù)措施。

中醫(yī)藥在肝病的治療中有悠久的歷史,發(fā)揮了重大作用。中藥單體具有潛在的治療價值。大黃具有退黃、清熱利濕效果,在肝病中應(yīng)用廣泛。大黃素是中藥大黃的有效成分之一,具有抑制炎癥反應(yīng)、保護肝細胞的作用[5]。但是大黃素保護肝細胞的機制并不明確。我們應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段篩選大黃素保護肝損傷的潛在靶點,選擇D-GalN作為誘導(dǎo)ALF的肝毒性藥物[6],通過細胞實驗驗證大黃素作用的靶點和通路。

1 材料與方法

1.1 收集大黃素和急性肝損傷的潛在靶點 首先,在TCMSP網(wǎng)站查找大黃素的潛在靶點。其次,在GeneCards數(shù)據(jù)庫以“Acute liver failure” 和“Fulminant Hepatic Failure”為關(guān)鍵詞查找急性肝損傷的靶點基因。我們在UniProt數(shù)據(jù)庫進一步找到基因的正式名稱。通過韋恩圖分析大黃素和急性肝損傷之間的靶點基因交集。

1.2 基因功能注釋和KEGG通路分析 將韋恩分析得到的交集基因?qū)隟OBAS數(shù)據(jù)庫,選擇物種為人,設(shè)置閾值為P<0.05。整個預(yù)測過程如圖1所示。

圖1 KEGG富集分析結(jié)果氣泡圖

1.3 試劑和抗體 人正常肝細胞(L02)購于中國科學(xué)院細胞庫,D-GalN(G1639)購自Sigma公司,大黃素(Emodin)購自Abmol公司,二甲基亞砜購自Sigma公司,細胞凋亡試劑盒購自翌圣生物科技公司。

1.4 細胞培養(yǎng) 90% DMEM,10%胎牛血清配置培養(yǎng)基。對照組細胞以正常培養(yǎng)基培養(yǎng),模型組細胞加入D-GalN作用12 h,治療組細胞以特定濃度的大黃素溶解在二甲基亞砜中預(yù)處理細胞12 h,12 h后加D-GalN損傷肝細胞。

1.5 細胞增殖測試 CCK-8法檢測L02細胞增殖活力,為確定D-GalN的最佳作用濃度和大黃素的治療濃度,將L02細胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔細胞數(shù)5 000個,在37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,分別用0、5、10、25、50 μmol/L大黃素溶液處理細胞。24 h時分別加入10、20、30、40、50 mmol/L D-GalN溶液處理細胞。在干預(yù)12 h后,用CCK-8在全自動酶標儀上檢測450 nm波長處各孔的吸光度值,計算各組細胞增殖活力,確定最佳作用濃度。

1.6 實時熒光定量PCR 用Trizol法抽提總RNA,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,以cDNA為模板進行PCR擴增,體系(20 μl)為SYBR Green Mix 10 μl,正向、反向引物各0.8 μl,無菌無酶水6.4 μl,cDNA模板2.0 μl;反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性30 s,98℃變性5 s,60℃退火30 s,循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參,采用2^-CT法計算目的基因mRNA相對表達,設(shè)置3個復(fù)孔。

1.7 流式細胞術(shù) 將人肝細胞接種到6孔板內(nèi),每孔細胞數(shù)5×103個。按照1.4中分組方法處理,磷酸緩沖鹽溶液洗滌后,將細胞懸浮在100 μl的結(jié)合緩沖液中,加入膜聯(lián)蛋白V-FITC(annexin V-FITC)10 μl、碘化丙啶(PI)5 μl,室溫結(jié)合15 min,加入400 μl結(jié)合緩沖液置于冰上,流式細胞儀檢測。

1.8 蛋白印跡法測定L02細胞BCL2、Cleaved-Caspase-3水平從L02細胞中提取總蛋白,BCA法檢測蛋白含量,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜封閉孵一抗(Cleaved-Caspase-3、BCL2、β-actin,稀釋倍數(shù)1∶1 000),4℃過夜,洗膜,孵二抗,室溫下孵育2 h,洗膜,曝光顯色,凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白的相對表達情況。

2 結(jié)果

2.1 大黃素治療急性肝衰竭的基本靶點分析 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集到34個大黃素的作用靶點。然后通過Genecard數(shù)據(jù)庫收集9 445個急性肝衰竭相關(guān)靶點。韋恩分析顯示,大黃素和急性肝衰竭之間共有29個交集靶點(見表1)。

表1 大黃素與急性肝衰竭的共同靶點

2.2 基因功能注釋及KEGG通路富集分析 KOBAS是富集分析的在線數(shù)據(jù)庫,可以進行基因功能注釋和GO富集分析。大黃素與急性肝損傷交集基因的功能注釋結(jié)果顯示,大黃素與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)、細胞凋亡、蛋白功能修飾相關(guān)。KEGG富集分析表明,大黃素具有廣泛的藥理作用,涉及的通路包括非洲錐蟲病、甲狀腺癌、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、糖尿病并發(fā)癥、Ⅱ型糖尿病、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、胰島素抵抗、組氨酸代謝、松弛素信號通路、雌激素信號通路、原發(fā)性免疫缺陷、補體和凝血級聯(lián)、血小板活化(圖1)。提示相關(guān)疾病和通路是相互關(guān)聯(lián)的,說明大黃素通過協(xié)調(diào)不同的生物學(xué)過程發(fā)揮保護急性肝損傷的功能。我們對與細胞凋亡和糖代謝相關(guān)的基因進行細胞實驗驗證。

2.3 細胞增殖實驗 CCK8檢測結(jié)果表示,與空白培養(yǎng)基組相比,D氨基半乳糖胺藥物濃度大于40 mmol/L時,對L02細胞的損傷作用明顯,細胞存活率明顯下降(P<0.001)。我們選取40 mmol為D氨基半乳糖胺的造模劑量。大黃素>25 μmol/L時細胞抑制作用明顯,因此我們選取對細胞存活率無影響的5、10 μmol/L作為治療劑量。大黃素劑量為10 μmol/L時對D氨基半乳糖胺造成的肝細胞生長抑制作用有明顯的逆轉(zhuǎn)作用。(圖2)。

圖2 各組細胞增殖結(jié)果

2.4 實時熒光定量PCR qRT-PCR檢測SLC2A1、SLC2A4和Caspase-3表達水平,與對照組相比較,D氨基半乳糖胺模型組的SLC2A1、Caspase-3基因水平上調(diào),而SLC2A4水平下調(diào)。大黃素治療組mRNA水平與D-GalN模型組相比SLC2A1、Caspase-3顯著變化下調(diào)(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001),見圖3。

圖3 各組細胞mRNA相對表達量

2.5 各組細胞凋亡情況 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,與對照組相比D-GalN模型組細胞總凋亡率顯著增加(P<0.001),總凋亡細胞比例從(4.82±1.10)%增加至(29.76±1.83)%,與D-GalN模型組相比,大黃素治療組細胞凋亡率降低至(18.29±1.10)%(P<0.001 )。Q1：機械損傷;Q2：晚期凋亡;Q3：正常;Q4：早期凋亡;總凋亡=Q4+Q2。見圖4。

圖4 各組細胞凋亡情況

2.6 蛋白表達水平 與對照組相比,D-GalN模型組Cleaved-Caspase-3蛋白表達增加,而大黃素干預(yù)可使損傷肝細胞組的Cleaved-Caspases-3蛋白表達降低,大黃素治療后BCL2蛋白表達上調(diào)(圖5) 。

圖5 Cleaved-Caspases-3和BCL2蛋白表達情況

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果提示急性肝衰竭是一個多通路參與的、復(fù)雜的病理生理過程,大黃素可能通過激活細胞凋亡信號通路、Ⅱ型糖尿病信號通路、苯丙氨酸代謝信號通路、色氨酸代謝信號通路等多個通路發(fā)揮抗肝損傷的作用。肝細胞凋亡是一種重要的肝細胞死亡形式。肝細胞凋亡是急性肝衰竭早期的一種重要病理學(xué)表現(xiàn)。BCL2是抑癌基因,激活BCL2減少細胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生,抑制線粒體途徑的細胞凋亡,抑制Caspase3表達[7]。 Caspase3是多種凋亡刺激信號傳遞最主要的終末執(zhí)行酶,其以無活性前體存在于細胞中,當細胞進入凋亡時被激活,從而進入細胞核中執(zhí)行凋亡效應(yīng),使得染色質(zhì)凝集、DNA片段化、凋亡小體形成[8]。大黃素拮抗D-GalN引起的肝細胞增殖抑制可能與上調(diào)BCL2蛋白表達,抑制肝細胞凋亡相關(guān)。

急性肝衰竭低血糖風險增加,通常通過靜脈輸注葡萄糖預(yù)防[9]。葡萄糖主要通過溶質(zhì)-載體基因家族SLC2A1進入細胞,SLC2A1過表達促進葡萄糖轉(zhuǎn)運至細胞,加快糖酵解產(chǎn)生的乳酸排出細胞,促進細胞凋亡[10]。我們的研究也證實了急性肝損傷發(fā)生時SLC2A1表達上調(diào)、SLC2A4表達下調(diào)。與D氨基半乳糖胺模型組相比,大黃素治療后SLC2A1表達量下調(diào),細胞凋亡率降低。因此,推測大黃素減輕肝損傷的作用可能與抑制SLC2A1的表達,減少細胞攝入葡萄糖,減緩乳酸排除相關(guān)。

本實驗結(jié)果顯示,大黃素能對抗D氨基半乳糖胺導(dǎo)致的肝細胞增殖抑制,上調(diào)BCL2蛋白表達,減少Cleaved-Caspase-3的表達,抑制基因SLC2A1和Caspase-3表達,表明大黃素可能通過調(diào)節(jié)BCL2和SLC2A1多途徑發(fā)揮抗凋亡作用,從而減輕D氨基半乳糖胺所致肝細胞損傷。大黃素減輕急性肝損傷的機制可能為臨床緩解急性肝衰竭和低血糖并發(fā)癥提供一種潛在的新途徑。