高明生 姚 勇 奉 鐳

遂寧市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 (四川 遂寧, 629000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種常見的慢性肝病,與肥胖、糖尿病等代謝性疾病的高患病率密切相關(guān)[1]。NAFLD的早期特征是在沒有大量飲酒的情況下,三?；视头e聚(>5%～10%的肝細(xì)胞),隨著疾病進(jìn)展可能會(huì)發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH),并在晚期發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌[2]。游離脂肪酸(FFA)具有脂毒性,其代謝異?？梢鸶渭?xì)胞脂質(zhì)沉積,損傷肝細(xì)胞器及胰島素通路[3]。研究顯示,NAFLD患者血中FFA水平高于健康人群,FFA與NAFLD病變程度有關(guān)[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,FFA可誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)變性,其可作為NAFLD的體外細(xì)胞模型,對(duì)NAFLD的發(fā)病機(jī)制研究有重大意義[5]。竹節(jié)參為五加科草本植物,現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)其具有降血脂、抗氧化、抗炎等功效,可改善糖脂代謝,竹節(jié)參總皂苷(TSPJ)是其主要活性成分[6]。TSPJ已被證實(shí)不僅能夠通過抑制炎癥發(fā)生改善NASH,還能通過靶向雌激素β受體改善HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積累[7,8],但其有關(guān)的機(jī)制研究仍然匱乏。研究表明,高遷移率族蛋白1(HMGB1)和Toll樣受體4(TLR4)與炎癥和肝功能衰竭密切相關(guān),HMGB1能夠激活核因子-κB(NF-κB),并通過TLR4和B受體晚期糖化終產(chǎn)物促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)展[9]。目前,TSPJ能夠改善小鼠NAFLD[10],但其是否與HMGB1信號(hào)通路相關(guān)尚不明確?；诖?本研究通過FFA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2構(gòu)建肝細(xì)胞脂肪變性模型,探討TSPJ對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞HepG2,武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 藥物及制備 竹節(jié)參(湖北恩施竹節(jié)參種植基地),經(jīng)鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參干燥根莖。粉碎為粗粉,以1∶10的比例加入60%乙醇,浸泡2 h,加熱后回流提取,將所得提取液濃縮至無醇后,加水離心,所得上清經(jīng)正丁醇萃取,減壓濃縮,獲得正丁醇浸膏。加水,過D101大孔樹脂,采用水、10%、30%、60%、90%乙醇依次沖洗,洗脫流量為1 ml/min。將各洗脫部位減壓濃縮,真空干燥,得10%、30%、60%、90% TSPJ洗脫部位,低溫保存。使用前,稱取10 mg TSPJ洗脫提取物,DMSO(100 μl)溶解,加PBS 900 μl,配置成10 mg/ml母液。

1.1.3 主要試劑與儀器 HMGB1、TLR4、NF-κB及GAPDH兔多克隆抗體(ab18256、ab150583、ab16502、ab9485)、Oil Red O Stain試劑盒(ab150678),英國abcam公司;TRIzol試劑(15596026)、Revert aidTM First Strand cDNA Synthsis Kit(K1622)、LipofectamineTM2000試劑盒(11668019),美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在DEME培養(yǎng)液(含1%青鏈霉素混合液、10%胎牛血清)中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞,培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2,細(xì)胞生長至80%～90%時(shí),胰蛋白酶(0.25%)消化。

1.2.2 不同濃度TSPJ及FFA對(duì)HepG2細(xì)胞毒性檢測 將對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞接種于96孔板,用DMEM培養(yǎng)基稀釋出不同濃度(0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L)的FFA(油酸：棕櫚酸=2∶1)誘導(dǎo)劑,TSPJ同樣采用DMEM培養(yǎng)基稀釋為不同濃度12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml。HepG2細(xì)胞貼壁后,分別加入100 μl含不同濃度FFA及TSPJ的培養(yǎng)基,孵育24 h,加入10 μl CCK8溶液,孵育1～4 h,酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度(A)。計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3 siRNA設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中HMGB1 mRNA全長序列,以pGPU6/GFP/Neo為載體,設(shè)計(jì)HMGB1干擾靶序列質(zhì)粒,并構(gòu)建非特異性序列質(zhì)粒為陰性對(duì)照(HMGB1 p-NC),不同siRNA序列及陰性對(duì)照序列見表1,均由上海吉?jiǎng)P公司合成。

表1 HMGB1的不同siRNA序列和陰性對(duì)照序列

1.2.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及鑒定 HepG2細(xì)胞以2×105個(gè)/ml接種于6孔板,細(xì)胞生長至56%～60%時(shí),采用LipofectamineTM2000試劑盒將HMGB1 siRNA1、HMGB1 siRNA2、HMGB1 siRNA3及HMGB1 p-NC轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,記為HMGB1 siRNA1組、HMGB1 siRNA2組、HMGB1 siRNA3組及HMGB1 p-NC組。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液,孵育48 h～72 h,熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野,觀察各組HepG2細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)水平,計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率=暗視野綠色熒光細(xì)胞數(shù)/明視野細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 細(xì)胞分組 HepG2細(xì)胞分為7組,對(duì)照組(未處理)、FFA組(0.5 mmol/L FFA處理)、FFA+HMGB1 p-NC組(0.5 mmol/L FFA處理+HMGB1 p-NC轉(zhuǎn)染)、FFA+HMGB1 siRNA組(0.5 mmol/L FFA處理+HMGB1 siRNA2轉(zhuǎn)染)、FFA+TSPJ組(0.5 mmol/L FFA+50 μg/ml TSPJ處理)、FFA+pcDNA+TSPJ組(0.5 mmol/L FFA+pcDNA轉(zhuǎn)染+50 μg/ml TSPJ處理)、FFA+HMGB1 pcDNA+TSPJ組(0.5 mmol/L FFA+HMGB1 pcDNA轉(zhuǎn)染+50 μg/ml TSPJ處理)、FFA+HMGB1 p-NC+TSPJ組(0.5 mmol/L FFA+HMGB1 p-NC轉(zhuǎn)染+50 μg/ml TSPJ處理)、FFA+HMGB1 siRNA+TSPJ組(0.5 mmol/L FFA+HMGB1 siRNA2轉(zhuǎn)染+50 μg/ml TSPJ處理)。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況觀察及脂質(zhì)水平測定 取0.5 g油紅O粉末,100 ml異丙醇溶解過夜,并與三蒸水3∶2體積混合,過濾,得工作液。棄培養(yǎng)基,PBS洗滌,4%多聚甲醛固定,PBS洗滌。加油紅O工作液,染色15 min,PBS洗滌,顯微鏡下觀察脂質(zhì)蓄積情況,并拍照。觀察結(jié)束,每孔加200 μl異丙醇,振搖脫洗,洗脫液置于96孔板,酶標(biāo)儀檢測450 nm處A值。A值越大,脂質(zhì)水平越高。

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)TG含量檢測 使用裂解液裂解1.2.5中各組HepG2細(xì)胞,12 000 r/min、4℃離心10 min,取上清,采用分光光度法測定各組細(xì)胞TG含量,按照TG含量測試盒說明書操作。

1.2.8 qRT-PCR法檢測HepG2細(xì)胞HMGB1 mRNA水平 TRIzol試劑提取各組HepG2細(xì)胞總RNA,檢測濃度及純度,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用cDNA配置qRT-PCR反應(yīng)體系。熒光定量PCR儀上擴(kuò)增,2-△△Ct法計(jì)算HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量,篩選最有效的HMGB1 siRNA干擾序列。HMGB1上游引物：5′-AATAGGAAAAGGATATTGCT-3′,下游引物5′-GCGCTAGAA-CCAACTTATGA-3′;TLR4上游引物：5′-AGTGGCTGGATTTA-TCCAGGTGTG-3′,下游引物5′-TTGAGAGGTGGTGTAAGCC-ATGCC-3′,NF-κB上游引物：5′-ACACGAGGCTACAACTCTGC-3′,下游引物：5′-GGTACCCCCAGAGACCTCAT-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.2.9 HMGB1通路相關(guān)基因蛋白水平檢測 RIPA裂解液充分裂解各組HepG2細(xì)胞,冰浴,提取總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)至PVDF膜,脫脂奶粉封閉2 h,加入GAPDH、HMGB1、TLR4、NF-κB一抗(1∶1 000),4℃過夜,TBST洗膜3次,加二抗(1∶3 000),室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,加入ECL顯色、成像,掃描各蛋白條帶灰度值并分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度FFA、TSPJ細(xì)胞毒性 HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度FFA處理24 h后,0.25 mmol/L、0.5 mmol/L FFA組HepG2細(xì)胞存活率(97.36±2.17)%、(96.48±2.26)%與對(duì)照組(100.00%)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),1.0 mmol/L、2.0 mmol/L FFA組HepG2細(xì)胞存活率分別為(72.59±5.42)%、(31.27±3.86)%,較對(duì)照組分別下降27.41%、68.73%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此選擇0.5 mmol/L FFA為最佳誘導(dǎo)濃度。

HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度TSPJ處理24 h后,12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml TSPJ組HepG2細(xì)胞存活率(95.89±2.94)%、(94.65±3.06)%、(93.71±2.85)%,與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),100 μg/ml TSPJ組HepG2細(xì)胞存活率為(64.82±5.17)%,較對(duì)照組降低35.18%(P<0.05),因此選擇50 μg/ml TSPJ為最佳誘導(dǎo)濃度。

2.2 HMGB1 siRNA有效干擾序列篩選 HMGB1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h,熒光倒置顯微鏡下激發(fā)波長480 nm,發(fā)射波長500 nm,觀察綠色熒光,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h后熒光最強(qiáng),轉(zhuǎn)染效率最高(約71%),此時(shí)開始進(jìn)行篩選。

HMGB1 siRNA1、HMGB1 siRNA2、HMGB1 siRNA3組HMGB1 mRNA及蛋白水平與對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HMGB1 p-NC組HMGB1 mRNA及蛋白水平與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、2。HMGB1 siRNA2組HMGB1沉默效果最佳,選擇HMGB1 siRNA2為有效干擾序列。

圖1 Western blot檢測不同HMGB1 siRNA質(zhì)粒沉默后HepG2細(xì)胞中HMGB1蛋白的表達(dá)情況

圖2 HepG2細(xì)胞中不同HMGB1 siRNA質(zhì)粒沉默HMGB1的表達(dá)情況 與對(duì)照組比較,aP<0.05

2.3 TSPJ對(duì)FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積及TG含量的影響 見表2、圖3。

圖3 油紅O染色觀察各組HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積 (×400)

表2 TSPJ對(duì)FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積及TG含量的影響

2.4 干擾HMGB1對(duì)FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積及TG含量的影響 見圖4、表3。

圖4 油紅O染色觀察各組HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積 (×400)

表3 干擾HMGB1對(duì)FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積及TG含量的影響

2.5 過表達(dá)HMGB1對(duì)TSPJ處理的FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積及TG含量的影響 見圖5、表4。

圖5 油紅O染色觀察HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響 (×400)

表4 TSPJ對(duì)FFA誘導(dǎo)的HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)的影響

表4 過表達(dá)HMGB1對(duì)TSPJ處理的FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積及TG含量的影響

2.6 TSPJ對(duì)FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞HMGB1通路相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響 見圖6、圖7、表4。

圖6 Western blot檢測各組HepG2細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

圖7 qRT-PCR檢測各組HepG2細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)

3 討論

NAFLD發(fā)病率隨著近年來飲食習(xí)慣、生活方式的改變而迅速增加,肝細(xì)胞脂質(zhì)過度沉積、脂肪變性是NAFLD的主要病理特征[11]?！岸啻未驌魧W(xué)說”是目前NAFLD較為公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制,“第一次打擊”以胰島素抵抗為主,肝臟發(fā)生脂肪變性;“第二次打擊”中肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、過氧化應(yīng)激、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及腸道衍生內(nèi)毒素等;“第三次打擊”中,肝臟免疫紊亂,從而引發(fā)肝細(xì)胞缺血壞死、肝纖維化、肝硬化等[12]。因此可知,NAFLD主要由肝臟脂質(zhì)代謝異常引發(fā)的肝細(xì)胞脂質(zhì)(TG過度沉積)聚積導(dǎo)致[13]。NAFLD細(xì)胞模型主要包括誘導(dǎo)多能肝細(xì)胞、永生細(xì)胞系、原代肝細(xì)胞等,因永生細(xì)胞系表型穩(wěn)定、生長穩(wěn)定、易于標(biāo)準(zhǔn)化及無限壽命等特點(diǎn),是構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型的最佳選擇[14]。HepG2細(xì)胞作為永生細(xì)胞系具有永生化、表型穩(wěn)定、易于操作等特點(diǎn),因此本研究選取HepG2細(xì)胞進(jìn)行研究。FFA可在信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞膜合成、能量儲(chǔ)存等過程中發(fā)揮重要作用,其代謝失調(diào)可導(dǎo)致肥胖、肝臟脂肪變性、高血脂、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[15]。本研究中,采用FFA處理HepG2細(xì)胞后,HepG2細(xì)胞脂滴數(shù)增加,脂質(zhì)及TG水平均顯著增加,與Lee等[16]和Long等[17]的研究結(jié)果一致,提示體外肝臟脂肪沉積模型構(gòu)建成功。

竹節(jié)參是中國西南地區(qū)常見中草藥,兼具南藥三七及北藥人參的作用。TSPJ為竹節(jié)參主要活性成分,能夠改善由化學(xué)藥品、高脂飲食等引發(fā)的肝損傷。研究發(fā)現(xiàn),TSPJ作用于高糖高脂飲食小鼠,可能通過調(diào)節(jié)miR-199a-5p/ATG5信號(hào)通路改善NASH炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)自噬[7]。本研究中,TSPJ干預(yù)后,NAFLD模型細(xì)胞脂滴數(shù)減少,脂質(zhì)及TG水平降低,這與TSPJ在NAFLD小鼠模型中的作用一致[18],提示TSPJ可減少脂質(zhì)蓄積,進(jìn)而影響NAFLD疾病進(jìn)展,但其具體作用機(jī)制尚不明確。

HMGB1是一種豐富的結(jié)構(gòu)染色體蛋白,具有多種生物學(xué)功能：基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)和炎癥細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等[19]。HMGB1參與肝臟纖維化、炎癥及損傷等過程,在NAFLD、肝細(xì)胞癌、肝缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[20]。Lai等[21]研究發(fā)現(xiàn),抑制HMGB1表達(dá)可抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞和HepG2細(xì)胞TG水平。此外,在肝損傷或肝壞死等病理情況下,HMGB1可激活NF-κB通路,維持機(jī)體炎癥環(huán)境,從而導(dǎo)致組織損傷[22]。研究還發(fā)現(xiàn),HMGB1為TLR4上游信號(hào)分子,HMGB1可通過TLR4通路影響肝臟炎癥反應(yīng)[23]。有研究指出,TSPJ對(duì)于肝臟損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)具有良好的治療效果,這很可能與抑制HMGB1的表達(dá)有關(guān)[24]。同時(shí)劉正泰等[25]研究發(fā)現(xiàn),TSPJ可能通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路改善大鼠脂肪細(xì)胞排列及脂肪組織炎癥。與上述研究類似的是,經(jīng)0.5 mmol/L FFA處理的HepG2細(xì)胞,HMGB1蛋白、mRNA水平及TLR4、NF-κB蛋白水平升高,提示FFA可調(diào)控下游HMGB1通路發(fā)揮作用;而抑制HepG2細(xì)胞HMGB1表達(dá)后,FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)水平、TG含量及TLR4、NF-κB蛋白水平均降低,提示HMGB1表達(dá)下調(diào)可抑制下游TLR4/NF-κB通路激活,從而緩解炎癥、減少肝臟脂質(zhì)積累,對(duì)改善NAFLD有一定幫助。采用TSPJ干預(yù)后可降低HepG2細(xì)胞HMGB1蛋白、mRNA水平及TLR4、NF-κB蛋白水平,TSPJ與HMGB1 siRNA聯(lián)用,與HMGB1 siRNA單獨(dú)干預(yù)比較,可進(jìn)一步降低上述因子的表達(dá);TSPJ與HMGB1 pcDNA聯(lián)用,與TSPJ單獨(dú)干預(yù)比較,肝細(xì)胞炎癥加重,脂質(zhì)積累增加;提示TSPJ可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路改善肝細(xì)胞變性,從而緩解NAFLD。