邵華卿 張春蕾 陳旭東 王 磊

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院檢驗(yàn)科 (上海, 200032) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院急診科 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肝病科

慢性乙型病毒性肝炎(CHB)是我國傳染病重大傳染病之一,乙型肝炎病毒(HBV)持續(xù)感染是導(dǎo)致本病發(fā)生的關(guān)鍵[1,2]。外周血單個核細(xì)胞(PBMC)包含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等,在HBV的清除過程中發(fā)揮著重要的作用,除能夠提呈抗原、直接清除感染病毒的肝細(xì)胞外,還可以分泌大量細(xì)胞因子參與病毒的清除[3,4]。血液中的各類細(xì)胞因子具有強(qiáng)大免疫調(diào)節(jié)功能,能夠激活或抑制機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫從而影響HBV的清除,研究顯示細(xì)胞因子平衡的紊亂、關(guān)鍵因子的缺乏可能是導(dǎo)致HBV慢性感染的重要因素[5-9]。了解病毒刺激后細(xì)胞因子的分泌時間變化規(guī)律有助于選擇恰當(dāng)實(shí)驗(yàn)時機(jī)提高實(shí)驗(yàn)研究的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1 試劑 用于分離PBMC的血液樣本全部來自龍華醫(yī)院招募的健康志愿者。乙型肝炎病毒取自HepG 2.2.15細(xì)胞濃縮上清液。CBA檢測試劑盒：IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子捕獲微球、CBA Human Soluble Protein Master Buffer Kit均購自BD公司。Amicon Ultra-15(100 kd)超濾離心管購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的分離 無菌條件下采集各組患者及健康志愿者外周血10 ml后PBS等倍稀釋混勻;50 ml的離心管中加入2倍血液的淋巴細(xì)胞分離液,將混勻的血液緩慢加入在含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,室溫1 500 rpm/min離心20 min;離心后離心管內(nèi)分為3層：上層為血清和PBS液,下層主要為紅細(xì)胞,中層為淋巴細(xì)胞分離液。在上、中層界面處以單個核細(xì)胞為主的灰白色云霧帶;輕輕抽取灰白色云霧層的細(xì)胞加2倍PBS懸浮,依次1 200 rcf/min、1 000 rcf/min各10 min、5 min洗滌兩次;洗滌結(jié)束加入適量含血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸,加入6孔板培養(yǎng)每孔加入1.5 ml培養(yǎng)基,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/孔,置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2 乙型肝炎病毒對PBMC的干預(yù) 以含血清及G418(0.2 μg/ml)的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HepG 2.2.15細(xì)胞,3 d后收集培養(yǎng)上清液,Millipore-Amicon Ultra-15(100 kd)離心管,2 500 rpm離心25 min,調(diào)整HBV DNA含量>5×106IU/ml。對照組以全血清培養(yǎng)基加入培養(yǎng)4 h的PBMC中共培養(yǎng);病毒組將含有乙型肝炎病毒的HepG2.2.15培養(yǎng)上清,以每孔病毒濃度為5×105IU/ml加入培養(yǎng)4 h的PBMC中共培養(yǎng);分別在共培養(yǎng)4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h后收集培養(yǎng)上清進(jìn)行細(xì)胞因子檢測。

1.2.3 細(xì)胞因子檢測 細(xì)胞因子檢測采用流式多因子檢測技術(shù)(CBA)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0 軟件,計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。同一時間點(diǎn)組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);同組不同時間點(diǎn)比較采用單因素方差分析,如方差不齊采用Games-Howell。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空白對照組各細(xì)胞因子動態(tài)變化結(jié)果 空白對照組各細(xì)胞因子含量變化曲線較為平緩,IL-2、IL-17A含量隨時間變化呈上升趨勢48 h內(nèi)未達(dá)到峰值;IL-4、IL-6含量達(dá)峰時間為36 h,IL-10為12 h,TNF-ɑ為8 h,IFN-γ為4 h;各因子各時間點(diǎn)含量較4 h均有不同程度差異(均P<0.05)。

2.2 病毒干預(yù)組各細(xì)胞因子動態(tài)變化 病毒干預(yù)組IL-2的含量隨時間變化呈上升趨勢48 h內(nèi)未達(dá)到峰值;IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-ɑ含量隨時間變化呈先上升后下降趨勢,其中IL-4、IL-17A、IFN-、TNF-ɑ含量達(dá)峰時間為8 h,IL-10為24 h,IL-6為36 h;各因子各時間點(diǎn)含量較4 h均有不同程度差異(均P<0.05)。

2.3 兩組細(xì)胞因子變化 見表1～7。

表1 IL-2檢測結(jié)果

表2 IL-4檢測結(jié)果

表3 IL-6檢測結(jié)果

表4 IL-10檢測結(jié)果

表5 IL-17A檢測結(jié)果

表6 TNF-ɑ檢測結(jié)果

表7 IFN檢測結(jié)果

3 討論

細(xì)胞因子是由活化免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞分泌的一種低分子可溶性蛋白質(zhì),具有調(diào)節(jié)免疫、血細(xì)胞生成、細(xì)胞生長以及損傷組織修復(fù)等多種功能。根據(jù)不同來源可分為淋巴因子(LK)、單核因子(MK)及非淋巴細(xì)胞、非單核因子,各類細(xì)胞因子通過旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式發(fā)揮作用,形成了十分復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),參與人體多種重要的生理功能。LK、MK主要參與了機(jī)體免疫的調(diào)控,在構(gòu)建機(jī)體免疫防御、維持正常免疫平衡上發(fā)揮著重要的作用,細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)是紛繁復(fù)雜的,不但各因子之間、各因子與細(xì)胞之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響,同時又是動態(tài)變化的。因此,了解各個細(xì)胞因子分泌時間特征,將有助于了解機(jī)體免疫應(yīng)答過程,準(zhǔn)確選擇藥物干預(yù)時間節(jié)點(diǎn),使實(shí)驗(yàn)研究更加準(zhǔn)確有效。

Th1/Th2細(xì)胞因子在HBV侵入人體時發(fā)揮著重要的抗病毒作用,Th1細(xì)胞因子主要包括IL-2、IFN-、TNF-ɑ等,IL-2具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞生長、提高吞噬細(xì)胞的活性、刺激分泌免疫干擾素、誘導(dǎo)和增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)[10,11]。IFN-主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生,通過激活A(yù)PC功能和巨噬細(xì)胞、NK、CTL細(xì)胞功能發(fā)揮抗病毒作用[12,13]。TNF-ɑ可殺傷腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)CTL對靶細(xì)胞殺傷[14]。Th2細(xì)胞因子主要包括IL-4、IL-6、IL-10等。IL-4可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化、促進(jìn)IgE、IgG的產(chǎn)生并抑制Th1分泌IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子,下調(diào)細(xì)胞免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)Th2細(xì)胞生成[15]。IL-6可促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化,合成分泌Ig,促進(jìn)T細(xì)胞增殖分泌,參與炎癥反應(yīng)[16]。IL-10可抑制巨噬細(xì)胞功能,降低抗原遞呈作用,減少單核因子生成;抑制Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子,下調(diào)細(xì)胞免疫;促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體生成,上調(diào)體液免疫[17]。

研究發(fā)現(xiàn)Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡失調(diào),可導(dǎo)致HBV清除障礙,HBV感染慢性化可能與Th2細(xì)胞因子增高有關(guān),IL-17A、TNF-ɑ的高表達(dá)可加重了肝臟炎癥反應(yīng)[9]。HBeAg可以明顯抑制Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生,促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子IL-6和IL-10分泌,上調(diào)外周血PBMC表面PD-1/PD-L1的表達(dá),從而有利于形成對HBV感染的免疫耐受[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HBV干預(yù)后PBMC分泌抗病毒因子IFN-γ減少,免疫抑制性因子IL-10、炎癥因子IL-6、IL-17A、TNF-ɑ等均不同成都升高,與既往體內(nèi)研究一致,同時觀察了IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-ɑ各細(xì)胞因子分泌高峰和時間動態(tài)曲線,為進(jìn)一步的藥物干預(yù)選擇合適的檢測時間節(jié)點(diǎn)研究提供了參考。