張夢(mèng)麗 廉瑞 丁婷婷 趙悅 馮怡華 王春玲

摘要：對(duì)醬油發(fā)酵用菌球擬酵母的安全性進(jìn)行了初步研究。通過(guò)抑菌圈、最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)與血平板實(shí)驗(yàn)研究菌種的耐藥性和溶血性；利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法探討了球擬酵母在醬油發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，球擬酵母對(duì)抗生素中的酮康唑、伏立康唑敏感，對(duì)氟康唑、兩性霉素B存在劑量依賴性，氟康唑?qū)η驍M酵母的MIC為4 μg/mL，兩性霉素B對(duì)球擬酵母的MIC為1 μg/mL，表明球擬酵母對(duì)兩性霉素B和氟康唑敏感，不具有耐藥性；血平板實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明球擬酵母不具備溶血性。添加球擬酵母的醬油在發(fā)酵終端的代謝產(chǎn)物分析中未檢測(cè)到有害物質(zhì)，且球擬酵母能利用原料中的糖類產(chǎn)生相應(yīng)的酯類物質(zhì)，并在添加球擬酵母的醬油中檢測(cè)到了較多的特征風(fēng)味化合物，如吡喃酮。

關(guān)鍵詞：醬油；球擬酵母；代謝特征；安全性

中圖分類號(hào)：TS264.21? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）04-0050-05

Abstract： A preliminary study is conducted on the safety of Torulopsis globosa used for soy sauce fermentation. The drug resistance and hemolysis of bacteria are studied by bacteriostatic zone， minimum inhibitory concentration experiment and blood plate experiment; the volatile and non-volatile metabolites of T. globosa in the fermentation process of soy sauce are investigated by gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-mass spectrometry. The results show that T. globosa is sensitive to ketoconazole and voriconazole in antibiotics， and is dose-dependent on fluconazole and amphotericin B. The MIC of fluconazole to T. globosa is 4 μg/mL， and the MIC of amphotericin B to T. globosa is 1 μg/mL， indicating that T. globosa is sensitive to amphotericin B and fluconazole， and has no drug resistance. The results of blood plate experiment show that T. globosa has no hemolysis. No harmful substances are detected in the analysis of metabolites at the fermentation terminal of soy sauce added with T. globosa， and T. globosa can utilize sugar in the raw material to produce corresponding esters， and more characteristic flavor compounds such as pyrones are detected in soy sauce added with T. globosa.

Key words： soy sauce; Torulopsis globosa; metabolic characteristics; safety

醬油主要是以含蛋白質(zhì)和淀粉質(zhì)的原料為主要原料，經(jīng)一系列微生物發(fā)酵制成的具有特殊色、香、味的調(diào)味品[1]，因其具有獨(dú)特的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值備受歡迎。通過(guò)添加酵母菌來(lái)改善醬油的香氣成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[2-4]。酵母主要包括醇香型的魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和酯香型的球擬酵母（Torulopsis globosa）[5-6]，魯氏酵母利用醬醪中的糖進(jìn)行醇類的發(fā)酵，賦予醬油醇香，乙醇有一定的抑菌作用，有利于醬油的保存[7-9]。球擬酵母作為醬油釀造過(guò)程中的后熟酵母，可以利用發(fā)酵液中的醇類與醬油中的酸類物質(zhì)形成酯類物質(zhì)，參與醬醪成熟及香味物質(zhì)的生成，使醬油的酯香味更濃郁[10-12]。

菌種的安全直接關(guān)系到食品的安全與公眾健康，球擬酵母雖然是傳統(tǒng)發(fā)酵菌株，但目前關(guān)于其安全性的研究鮮有報(bào)道，且國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有具體、完整的醬油菌種安全評(píng)價(jià)方法。本研究通過(guò)探討球擬酵母的耐藥性[13-14]、溶血性[15-16]來(lái)確定菌種自身的安全性以及從酵母參與的醬醪發(fā)酵后的代謝組學(xué)分析等方面入手，考察其安全性，從而為其應(yīng)用安全性評(píng)價(jià)提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

球擬酵母（Torulopsis globosa）：天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心；豆粕、炒小麥：購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；氟康唑、兩性霉素B：上海源葉生物科技有限公司;藥敏紙片系列（制霉菌素、兩性霉素B）：上海橋星貿(mào)易有限公司；酮康唑、氟康唑、伏立康唑：上海欣中生物工程有限公司；YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖，yeast extract peptone dextrose）液體培養(yǎng)基、YPD瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂平板培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP 2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS質(zhì)譜儀、Multiskan GO酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；LRH-250-A生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 耐藥性實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 藥敏紙片法

采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法[17]。

向無(wú)菌的YPD固體培養(yǎng)基中加入100 μL濃度為1×105 CFU/mL的球擬酵母菌液，均勻涂布后用鑷子分別放入氟康唑、伏立康唑、酮康唑、兩性霉素B藥片，放入30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.1.2 最低抑菌濃度測(cè)定

根據(jù)CLSI M27-A3[18-19]中酵母菌稀釋法進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 溶血性實(shí)驗(yàn)[20]

于無(wú)菌操作臺(tái)上將血瓊脂平板倒置，去除其中液體，隨后分別使用接種環(huán)劃線金黃色葡萄球菌、球擬酵母于血瓊脂培養(yǎng)基上，金黃色葡萄球菌于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h，球擬酵母于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，觀察二者是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

1.3.3 醬油中球擬酵母代謝物測(cè)定

1.3.3.1 醬油發(fā)酵

制備種曲→大曲制作（豆粕與炒小麥）→蒸煮→接種制曲→成曲→加鹽水發(fā)酵→接入球擬酵母（不添加球擬酵母組記作A組，添加球擬酵母組記為B組）→醬醪發(fā)酵→成品。

1.3.3.2 揮發(fā)性代謝物

采用固相微萃取GC-MS法測(cè)定醬油中的揮發(fā)性代謝物[21]。

1.3.3.3 非揮發(fā)性代謝物

采用LC-MS法測(cè)定醬油中的非揮發(fā)性代謝物[22-23]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用 SIMCA 14.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；利用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 藥敏實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)皿放入30 ℃培養(yǎng)箱中觀察，培養(yǎng)48 h后得結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1中酮康唑和伏立康唑培養(yǎng)皿出現(xiàn)明顯抑菌圈，酮康唑抑菌圈直徑為4.6 cm，大于標(biāo)準(zhǔn)敏感值（2.8 cm），伏立康唑抑菌圈直徑為3.4 cm，大于標(biāo)準(zhǔn)敏感值（1.7 cm）。根據(jù)M27藥敏實(shí)驗(yàn)紙片法，判定球擬酵母對(duì)酮康唑和伏立康唑不具有抗藥性。

2.1.2 確定最低抑菌濃度

對(duì)沒(méi)有出現(xiàn)明顯抑菌圈的氟康唑和兩性霉素B進(jìn)行進(jìn)一步抗藥性實(shí)驗(yàn)。依據(jù)CLSI M27-A3中酵母菌稀釋法進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

判讀時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照相比，唑類藥物的最低抑菌濃度（MIC）應(yīng)抑制80%的真菌生長(zhǎng)，兩性霉素（多烯類）則要求達(dá)到100%生長(zhǎng)抑制。由圖2可知，氟康唑濃度在4 mg/L時(shí)，只有20%的球擬酵母能生長(zhǎng)，球擬酵母的生長(zhǎng)達(dá)到了80%抑制，因此氟康唑?qū)η驍M酵母的MIC為4 mg/L。兩性霉素B濃度為1 mg/L時(shí)，球擬酵母完全不生長(zhǎng)，兩性霉素B對(duì)球擬酵母達(dá)到了100%抑制，故兩性霉素B對(duì)球擬酵母的MIC為1 mg/L。依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）藥物耐藥性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，兩性霉素B>4 μg/mL、氟康唑>64 μg/mL。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明球擬酵母對(duì)兩性霉素B和氟康唑敏感，不具有耐藥性。

2.2 溶血實(shí)驗(yàn)

金黃色葡萄球菌和球擬酵母在血瓊脂平板上的劃線生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3。

由圖3可知，金黃色葡萄球菌于37 ℃培養(yǎng)12 h后，血平板觀察到淺色溶血區(qū)，出現(xiàn)了明顯溶血現(xiàn)象，球擬酵母于30 ℃培養(yǎng)36 h后，酵母在血平板培養(yǎng)基上可以正常生長(zhǎng)，且在培養(yǎng)的菌株周圍的瓊脂中沒(méi)有顯示綠色，也并沒(méi)有出現(xiàn)透明圈，表明血平板并未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，因此判定球擬酵母不是溶血性菌株，具有一定的使用安全性。

2.3 球擬酵母代謝物分析

2.3.1 揮發(fā)性代謝物分析

利用正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由圖4可知，組間分離效果很好，說(shuō)明加酵母組（B組）與不加酵母組（A組）代謝物差別很大，其中S-plot中實(shí)心點(diǎn)代表差異代謝物，球擬酵母的代謝物共15個(gè)，分為醛類、醇類、酸類、酮類、酯類、酚類，其中未發(fā)現(xiàn)有明顯毒害作用的物質(zhì)。由圖5可以更直觀地看出同一物質(zhì)在不同組間的含量差異，加入球擬酵母后整體的風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量都有一個(gè)較大的提升。酵母可產(chǎn)生乙醇，醇類與酸類會(huì)形成酯類，同時(shí)醇類也會(huì)氧化生成醛類、酸類，醇類、醛類、酸類和酯類組成醬油的香氣成分。酚類物質(zhì)是醬油中的典型呈味物質(zhì)，對(duì)醬油的香味構(gòu)成有重要的影響。還有有機(jī)酸類，它們都有特殊的芳香味，如代謝物中的棕櫚酸具有天然花香，在發(fā)酵過(guò)程中被醇類和醛類氧化。醛類主要由小麥在加熱處理和制曲過(guò)程中產(chǎn)生的酸類通過(guò)曲霉菌和酵母的作用轉(zhuǎn)化而成，對(duì)醬油的香味有重大影響。酮類本身不屬于風(fēng)味物質(zhì)，但微量的羥基化合物有果味或者焦糖香氣[24]，如代謝物中的2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮，這類具有環(huán)狀烯醇酮類的化合物大多具有焦糖味。它與麥芽酚等焦糖味的物質(zhì)相比，具有更好的水溶性，在味覺(jué)上呈現(xiàn)出的甜味更加突出。

2.3.2 非揮發(fā)性代謝物分析

利用OPLS-DA的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6中的橫坐標(biāo)展示樣本組間的差異，縱坐標(biāo)展示樣本組內(nèi)的差異。由OPLS-DA得分圖可知，樣本都處于95%置信區(qū)間內(nèi)，它的組內(nèi)存在一定差異，但組間差異更加顯著。對(duì)樣品檢測(cè)出的代謝物的相對(duì)含量進(jìn)行顯著性差異分析，以火山圖來(lái)進(jìn)一步展示兩組間代謝物的差異性大小情況和代謝物的數(shù)量分布情況。以加球擬酵母組對(duì)不加球擬酵母組而言，由圖7可知，兩組代謝物數(shù)量眾多且差異顯著，灰色圓點(diǎn)代表兩組間不具備明顯差異的代謝物（not significant），藍(lán)色圓點(diǎn)代表顯著性下調(diào)的差異代謝物（down-regulated），而紅色圓點(diǎn)代表顯著性上調(diào)的差異代謝物（up-regulated），也就是球擬酵母的相關(guān)代謝物。

將檢測(cè)到的顯著差異代謝物通過(guò)分類學(xué)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，球擬酵母的非揮發(fā)性代謝物質(zhì)有苯類、苯丙烷和聚酮化合物、核苷與核苷酸類似物、有機(jī)酸及其衍生物、有機(jī)氧化合物、有機(jī)雜環(huán)化合物、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子等物質(zhì)。用完全連鎖方法對(duì)酵母的差異代謝物進(jìn)行聚類分析，從熱圖中可更直觀地看出同一物質(zhì)在不同組間的含量差異。其中有機(jī)酸及其衍生物種類最多，多為賴氨酸類、谷氨酸類、L-肌肽等氨基酸組成，它們是提供醬油鮮味的主要物質(zhì)[25]，此外，酵母自溶產(chǎn)生的核酸類物質(zhì)也會(huì)使醬油的鮮味增強(qiáng)[26] 。與不加球擬酵母組相比，加球擬酵母組的糖類、醇類物質(zhì)減少，可能是被酵母利用生成酯類、酸類物質(zhì)。有文獻(xiàn)指出球擬酵母在高鹽條件下可以將醇類轉(zhuǎn)化為酯類[27]。此外，在球擬酵母代謝物中未發(fā)現(xiàn)明顯有毒物質(zhì)。

3 結(jié)論

本文從菌株耐藥性實(shí)驗(yàn)、溶血性實(shí)驗(yàn)以及其在發(fā)酵過(guò)程中的代謝組學(xué)等方面，對(duì)發(fā)酵食品用菌球擬酵母的安全性進(jìn)行了初步研究。確定了球擬酵母對(duì)酮康唑、伏立康唑兩種基本抗生素敏感；對(duì)氟康唑、兩性霉素B存在劑量依賴性；球擬酵母不是溶血性菌株，具有一定的使用安全性；在球擬酵母揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中均未檢測(cè)出有害代謝物；此外，也顯示球擬酵母是典型的酯香型酵母，對(duì)醬油的風(fēng)味起到至關(guān)重要的作用。本文初步證明了球擬酵母的安全性，后續(xù)可以通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)球擬酵母的安全性進(jìn)行更進(jìn)一步的探究，從而為其在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的應(yīng)用安全性提供更加科學(xué)、全面的理論依據(jù)，對(duì)傳承和發(fā)展我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品、促進(jìn)行業(yè)健康發(fā)展有重要意義。

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