周羿宇,孟德超,何永成,王 成,余 杰,張朝文,鄒元鋒

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院天然藥物研究中心,成都 611130)

中藥材川芎為傘形科藁本屬植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根莖。夏季當(dāng)莖上的節(jié)盤顯著突出并略帶紫色時(shí)采挖,除去泥沙,曬后烘干,再去須根。川芎入藥已有兩千年歷史,首載于《左傳》,入藥始于《神農(nóng)本草經(jīng)》上品,有“川芎味辛、溫,主治中風(fēng)人腦頭痛、寒痹、筋攣緩急、婦人血閉無子”之稱。主產(chǎn)于四川省彭州、都江堰等地,為四川的道地藥材之一[1]?！皞€(gè)頭大飽滿、質(zhì)地堅(jiān)實(shí),斷面色為黃白、油性大、香氣濃郁者”為優(yōu)?！侗静荼阕x》中記載“辛甘微苦,能解郁調(diào)經(jīng);溫宣之性,能疏血分寒”[2],為中醫(yī)中活血行氣,法風(fēng)止疼之藥。川芎因其有效成分及藥用價(jià)值廣而備受關(guān)注,臨床上主要應(yīng)用于治療心腦血管、呼吸、泌尿系統(tǒng)及婦科方面的疾病?，F(xiàn)代研究表明其在抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血栓形成、促血管舒張、抗哮喘、抗呼吸抑制、抗纖維化、抗阻塞性疾病及抗腫瘤等方面發(fā)揮顯著的藥理作用。

揮發(fā)油是川芎主要活性成分,約占化學(xué)成分總量的1%,主要包括苯酞類、萜烯類、脂類、有機(jī)酸類等化合物。錢敏[3]通過GC-MS法測定川芎揮發(fā)油中含有29種成分,其中以藁本內(nèi)酯含量最多,其次是正丁烯基苯酞、丁基苯酞、α-萜品醇。另有學(xué)者[4]用GC-MS-DS方法分析,鑒定出40個(gè)化合物,占揮發(fā)油總組成93.64%,主要成分為藁本內(nèi)酯(58.00%),3-丁基苯酞(5.29%),香松烯(6.08%)。其他研究[5-7]均表明藁本內(nèi)酯為川芎揮發(fā)油的主要活性成分,可占揮發(fā)油總量的60%及以上。

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對各種損傷因子的刺激所發(fā)生的以防御反應(yīng)為主的基本病理生理過程,是損傷、抗損傷和修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程[8]。炎癥是機(jī)體重要的防御反應(yīng),適度的炎癥反應(yīng)有益于機(jī)體健康,但是在一定情況下對機(jī)體有潛在的威脅性。如病毒性心肌炎可以影響心臟功能[9]、細(xì)菌性腦膜炎的膿性滲出物可以引起顱內(nèi)壓增高[10]、結(jié)核性心包炎引發(fā)心包增厚[11]等。脂多糖(LPS)可刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW267.4)產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng),可在此基礎(chǔ)上建立體外炎癥細(xì)胞模型。炎癥反應(yīng)的過程中會(huì)釋放多種炎癥因子,從而調(diào)控整個(gè)炎癥反應(yīng)的進(jìn)程,例如一氧化氮(Nitric oxide,NO)、腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β (Interleukuin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6 (Interleukuin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-10 (Interleukuin-10,IL-10)等,這些炎癥因子的含量可以間接反應(yīng)炎癥發(fā)生的程度,常常作為檢測炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

研究利用水蒸氣蒸餾法分別對川芎非藥用部分和藥用部分中的揮發(fā)油進(jìn)行提取,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析鑒定其化學(xué)成分,通過LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞建立體外炎癥模型,給予系列濃度梯度的川芎藥用部分和非藥用部分揮發(fā)油溶液,采用qRT-PCR對IL-6炎癥因子進(jìn)行檢測,探究其抗炎作用。在同產(chǎn)地川芎原料基礎(chǔ)上,將藥用部分和非藥用部分中的揮發(fā)油的化學(xué)成分以及抗炎活性進(jìn)行比對,為擴(kuò)大川芎藥源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9070B 上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有效公司);恒溫電熱套(ZDHW 中興偉業(yè)儀器有限公司);電子天平(BS-210S 北京賽多利斯天平有限公司);顯微分光光度計(jì)(NanoDrop One/OneC 美國賽默飛公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司);高速冷凍離心機(jī)(美國賽默飛公司);倒置生物顯微鏡(Nikon)等。

1.2 材料

川芎(LigusticumchuanxiongHort.),根莖及莖葉采自眉山市彭山區(qū)川芎種植基地,經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)鄒元鋒副教授鑒定為川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的塊根及莖葉。

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(FBS;美國Gibco公司);青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司);Trizol試劑(RA101-02 北京博邁德基因技術(shù)有限公司);CCK-8試劑盒(Dojindo Molecular Technologies);胎牛血清(美國Gibco公司);脂多糖(LPS,Sigma,O55：B5);M-MLV4 First-Strand cDNA Synthesis Kit(Takara生物技術(shù)有限公司);SYBR premix Ex Taq II試劑盒(Takara生物技術(shù)有限公司)。

1.4 細(xì)胞株

小鼠RAW264.7單核-巨噬細(xì)胞(中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫)。

2 方法

2.1 提取方法

參照2020年版《中國藥典》四部通則2204《揮發(fā)油測定法》[1]進(jìn)行揮發(fā)油提取。精密稱取干燥川芎塊根及莖葉100 g(根莖切塊為1cm3,莖葉切段為1cm長),置于3000mL圓底燒瓶中,加水2000mL,充分混勻后浸泡2 h,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持微沸回流提取10 h,至測定器油量不再增加,分離油層,得川芎揮發(fā)油,計(jì)算提取得率,分裝于棕色瓶,置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 成分分析

分別取川芎藥用部分揮發(fā)油和非藥用部分揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS檢測,并聯(lián)用NIST 17數(shù)據(jù)庫自動(dòng)檢索。

2.2.1 氣相色譜柱 HP-5MS(60m×250μm×0.25μm)。

2.2.2 GC條件 進(jìn)樣口溫度280℃,氣質(zhì)接口溫度280℃,載氣流速1.5mL/min;進(jìn)樣量1μl;分流比100：1;升溫程序：初始50℃,保持0min;以5℃/min升溫到100℃保持5min;以4℃/min升溫到140℃保持5min;以4℃/min升溫到180℃保持5min;以5℃/min升溫到250℃保持5min;以10℃/min升溫到290℃保持10min。

2.2.3 MS條件 離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,EI電離70 eV,全掃描35～550 Da。

2.3 體外抗炎活性

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存與復(fù)蘇 (1)細(xì)胞培養(yǎng)。在超凈臺(tái)臺(tái)中,將含有一定數(shù)量RAW267.4細(xì)胞的細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi),并加入9mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,放入37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每12h觀察細(xì)胞狀態(tài)及生長情況。

(2)細(xì)胞傳代。待RAW267.4細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿80%左右傳代。將舊培養(yǎng)基移除,用提前在37℃水浴鍋預(yù)熱的0.1mol/L PBS沖洗2～3次,加入2mL0.25%的胰蛋白酶消化液,消化1min后移除所有胰酶,加入4mL的DMEM,用移液槍輕輕吹打貼壁的細(xì)胞使之脫落,收集細(xì)胞于10mL離心管,1000rpm/min,離心5min,棄上清,加入2mL的新培養(yǎng)液充分混勻,均勻添加至兩個(gè)裝有7mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約24h傳代1次,以保持細(xì)胞生長狀態(tài),維持適宜的細(xì)胞密度。

(3)細(xì)胞復(fù)蘇。從液氮中取出凍存管,迅速放入提前準(zhǔn)備的37℃水浴中,搖晃凍存管加速溶解(呈液態(tài),1 min為宜)。在超凈臺(tái)將溶解好的細(xì)胞移入到裝有9mL完全培養(yǎng)基的離心管,2000 rpm/min離心3 min,棄去上清液,用1～2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,再將細(xì)胞懸液加入裝有7mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日更換培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞的生長狀況。

2.3.2 細(xì)胞毒性測定 根據(jù)CCK-8檢測法,檢測川芎藥用部分和非藥用部分揮發(fā)油對RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。取川芎藥用部分和非藥用部分揮發(fā)油溶解在二甲基亞砜(DMSO)中,配置成0.1 mg/mL的母液,之后取適量母液配置所需濃度。將RAW 264.7細(xì)胞在96孔板上培養(yǎng)并孵育24 h。更換培養(yǎng)基后,在96孔板中添加不同濃度LPS(1.25、2.5、5、10、20、40、60μg/mL)、川芎藥用部分揮發(fā)油和川芎非藥用部分揮發(fā)油溶液(1.25、2.5、5、10、20、40、60、80μg/mL),并孵育12 h。按照CCK-8試劑說明加入試劑,每孔加入10μL的CCK-8試劑,孵育1h,使用酶標(biāo)儀,于450 nm波長出測量每孔吸光度并計(jì)算細(xì)胞毒性。

細(xì)胞活力(%)=(給藥組細(xì)胞OD值-空白OD/正常組的OD值-空白組OD值)×100%

2.3.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h(2×105個(gè)細(xì)胞/孔)。使用不同濃度的川芎藥用部分揮發(fā)油(2.5、5、10μg/mL)和川芎非藥用部分揮發(fā)油(2.5、5、10μg/mL)給藥并培養(yǎng)12 h,更換培養(yǎng)基后添加500 ng/mL的LPS溶液,孵育12 h,以誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥。用Trizol試劑提取RAW 264.7細(xì)胞的總RNA。用顯微分光光度計(jì)測量RNA濃度,并測定A260/280在1.6-2.0范圍內(nèi),用于定量測定炎癥細(xì)胞因子IL-6基因的相對表達(dá)。使用M-MLV4 First-Strand cDNA Synthesis Kit將分離的總RNA(5μg/μL)逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)嚴(yán)格使用SYBR premix Ex Taq II試劑盒。以β-actin(mouse)作為內(nèi)參數(shù),用△△Ct法計(jì)算,確定靶基因的相對表達(dá)量。RT-qPCR所用的引物見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

3 結(jié)果與分析

3.1 揮發(fā)油提取得率

采用水蒸氣蒸餾法分別對川芎藥用部分與非藥用部分進(jìn)行提取,提取得率結(jié)果見表2,川芎非藥用部分揮發(fā)油得率平均值為0.2845%,藥用部分揮發(fā)油得率平均值為0.2267%。

表2 川芎藥用部分和非藥用部分揮發(fā)油提取得率

3.2 GC-MS分析

提取得揮發(fā)油樣品經(jīng)氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀分析,聯(lián)用NIST 17數(shù)據(jù)庫進(jìn)行自動(dòng)檢索,并與相關(guān)文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)圖譜分析對比,然后以色譜面積歸一化法計(jì)算各組分的相對百分含量,分析得到不同部位川芎揮發(fā)油化學(xué)組分。

經(jīng)GC-MS分析,總共檢出112種揮發(fā)性成分,其中川芎藥用部分所得揮發(fā)油共中檢出87種,占總峰面積98.46%;從川芎非藥用部分所得揮發(fā)油中檢出65種,占總峰面積96.20%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,川芎揮發(fā)油主要成分為3-丁基苯酞(Butyl Phthalide)、3-丁叉苯酞(3-butylidene-phthalid)、松油烯醇-4(4-Terpineol)、N,N'-Diacetyl-1,4-phenylenediamine、乙位水芹烯(β-phellandrene)。表3、表4分別整理出非藥用部分和藥用部分含量最高的前十種揮發(fā)性成分,經(jīng)分析對比,相同成分共有兩種,分別為3-丁基苯酞(Butyl Phthalide)和3-丁叉苯酞(3-butylidene-phthalid),非藥用部分中含量分別為51.21%、1.78%,藥用部分中含量分別為55.08%、2.51%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明含量最高的成分均為3-丁基苯酞,非藥用部分和藥用部分分別含有51.21%、55.08%。

表3 川芎非藥用部分揮發(fā)油含量最高的前10種組分

表4 川芎藥用部分揮發(fā)油含量最高的前10種組分

川芎藥用部分揮發(fā)油和川芎非藥用部分揮發(fā)油的化學(xué)成分基本一致,但也存在部分差異。不同部分川芎揮發(fā)油具有40種共同化學(xué)成分,兩種揮發(fā)油各主要化學(xué)組分的百分含量存在差異,例如3-丁叉苯酞,其在川芎非藥用部分、藥用部分揮發(fā)油中的相對含量分別為1.78%、2.51%。不同部分川芎揮發(fā)油主要成分也具有一定差異,非藥用部分含有β-瑟林烯、α-瑟林烯、乙位石竹烯、大牛兒烯、反式-α-佛手甘油烯、β-欖香烯、α-畢橙茄醇等主要化學(xué)成分,具有一定的抗菌、抗真菌[12]、抗腫瘤、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用。藥用部分含有松油烯醇-4、乙位水芹烯、異松油烯、γ-松油烯、α-蒎烯、N,N-二乙酰-1,4-苯二胺、5-Pentylcyclohexa-1,3-diene等主要化學(xué)成分,具有抑制酶活性[13]、抗氧化[14]、清除自由基、殺蟲活性[15]等作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明川芎藥用部分和非藥用部分都具有相同的功效,但兩者的不同成分存在特殊藥用價(jià)值的可能性,擁有廣闊的研究價(jià)值。

3.3 川芎揮發(fā)油對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的影響

首先采用CCK-8試劑檢測川芎揮發(fā)油及LSP的細(xì)胞毒性(圖1),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三種溶液在實(shí)驗(yàn)濃度下對RAW 264.7細(xì)胞均無毒性。

圖1 川芎藥用部分 (A)、非藥用部分揮發(fā)油 (B)和LPS (C)對RAW267.4細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響

炎癥產(chǎn)生時(shí),局部血管擴(kuò)張,血漿及中性白細(xì)胞等血液成分滲出到組織內(nèi),細(xì)胞中的炎癥通路如LPS-TLR4/MD-2、Jak/Stat等被激活并釋放多種促炎細(xì)胞因子。IL-6是促炎癥細(xì)胞因子中的重要代表,其分泌水平可以反映炎癥反應(yīng)的程度。而LPS已被證實(shí)并應(yīng)用于誘導(dǎo)RAW 173.4細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激[16],與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(圖2),LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞后,IL-6的基因表達(dá)量顯著增加(P<0.001),進(jìn)一步考察川芎藥用部分揮發(fā)油和非藥用部分揮發(fā)油對炎癥因子分泌的作用效果。

圖2 川芎揮發(fā)油對LPS誘導(dǎo)RAW 267.4細(xì)胞炎癥中IL-6表達(dá)的影響注：C為空白組,M為模型組,LL、LM和LH分別為川芎非藥用部分揮發(fā)油低劑量(2.5μg/mL)、中劑量(5μg/mL)和高劑量(10μg/mL)組,RL、RM和RH分別為川芎藥用部分揮發(fā)油低劑量(2.5μg/mL)、中劑量(5μg/mL)和高劑量(10μg/mL)組。與LPS模型組相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與空白對照組相比#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;ns表示無顯著差異(P>0.05)。

與炎癥模型組相比(僅作LPS處理),LPS處理前經(jīng)過不同濃度給藥,其中川芎藥用部分中劑量(P<0.01)和高劑量組(P<0.001)對IL-6基因表達(dá)抑制作用顯著,低劑量組抑制作用不明顯(P>0.05);而川芎非藥用部分低劑量(P<0.01)、中劑量(P<0.001)和高劑量(P<0.001)組對IL-6基因表達(dá)抑制作用顯著,呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。結(jié)果說明,川芎藥用部分和非藥用部分揮發(fā)油對LPS誘導(dǎo)的RAW 267.4細(xì)胞炎癥反應(yīng)均有不同程度的抑制作用,而高劑量時(shí)作用最顯著,表明兩種揮發(fā)油在體外具有良好的抗炎活性,并不同程度降低了炎癥因子(IL-6)的含量。在本實(shí)驗(yàn)中,川芎藥用部分和非藥用部分揮發(fā)油有著相近的化學(xué)成分,表現(xiàn)出相似的抗炎效果,為進(jìn)一步利用川芎浪費(fèi)的非藥用部分作為抗炎物質(zhì)的藥用來源奠定了基礎(chǔ)。

4 討論與結(jié)論

川芎入藥歷史悠久,具有良好的藥用價(jià)值,藥用部位為成熟的川芎根莖,花莖葉等非藥用部分在成熟前因摘除而無法利用,存在潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前研究主要集中在不同提取揮發(fā)油的方法之間成分差異性的比較,還有不同產(chǎn)地川芎揮發(fā)油成分比較[17]。若加強(qiáng)對川芎莖葉,即非藥用部分的研究可以有效避免資源的浪費(fèi),提高全藥材的利用度。采用GC-MS分別對其藥用部分和非藥用部分揮發(fā)進(jìn)行成分分析,比較其成分的差異性與相似性,探究藥源開發(fā)的可能。

川芎揮發(fā)油的化學(xué)成分主要為各種萜類化合物,此外還含有醇、酯、醛、酮以及其衍生物。雖然川芎非藥用部分和藥用部分成分存在些許差異,但其主要成分含量基本相同,其中含量最高的組分都為3-丁基苯酞,它們分別含有51.21%、55.08%,含量接近。故川芎非藥用部分揮發(fā)油與藥用部分揮發(fā)油具有相似的功效。川芎揮發(fā)油中均未檢測出藁本內(nèi)酯成分,與文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]有差異,說明川芎的主要成分發(fā)生了變化,可能與源產(chǎn)地、存放時(shí)間、采收期等原因以及藁本內(nèi)酯的不穩(wěn)定性有關(guān),仍需進(jìn)一步考察。

革蘭氏陰性致病菌產(chǎn)生的LPS可產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),本研究中RAW267.4細(xì)胞經(jīng)過LPS誘導(dǎo)建立炎癥模型,炎癥因子IL-6顯著上調(diào)。經(jīng)過揮發(fā)油處理過后,由LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-6過度分泌被明顯抑制,且藥用部分和非藥用部分揮發(fā)油抗炎抑制作用相似,在體外均有良好的抗炎效果。研究表明,部分二萜類化合物存在優(yōu)異的抗炎活性[18],而萜類作為川芎揮發(fā)油的主要成分,推測其是其臨床抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ),存在進(jìn)一步研究價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)對川芎藥用部分和非藥用部分揮發(fā)油總體物的抗炎活性進(jìn)行對比,表明非藥用部分的抗炎效果與藥用部分同佳,為川芎全藥材利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),其作用機(jī)制仍缺乏相關(guān)研究。