李雙雙,潘忠成,2*,張心心,潘子瑜,鄭鵬飛,李金峰

(1.陜西麥可羅生物科技有限公司,陜西 渭南 714200;2.哈爾濱工程大學材料科學與化學工程學院教育部超輕材料重點實驗室,哈爾濱 150001;3.哈爾濱商業(yè)大學食品科學與工程學院,哈爾濱 150001 )

柑桔潰瘍病(CitrusBacterialCankerDisease,CBCD)是由地毯黃單胞桿菌(Xanthomonasaxonopodispv.Citri.Xac)柑桔致病變種引起的危害全球柑桔的重要作物病害,是國內外重點檢疫對象[1-2]。該病害對柑桔作物造成的危害極大,感染的程度會因物種的不同和品種的差異以及栽培管理措施和氣候條件等存在差異。柑桔潰瘍病菌與與其他許多細菌性病害類似,其病原菌借助風雨、昆蟲、修剪工具等從傷口、氣孔等侵入植株[1]。病菌的寄主范圍較廣泛,主要對蕓香科植物進行侵染,嚴重為害柑桔的葉、枝干及果實,引起葉片、枝干枝條及果實發(fā)生潰瘍斑,嚴重影響作物的正常長勢,產品品質及產量的下降,對柑桔作物生產影響重大[3]。病害侵染,葉背開始現類黃色極小油漬斑點,而后正背兩面隆起圓形黃米色病斑,表皮出現裂痕,粗糙木質化,病部凹陷有黃色暈環(huán)出現。枝梢病斑較葉片病斑更加凸起,病部凹陷但無暈環(huán),嚴重時葉枯枝枯,其中夏梢最嚴重。果實病斑較葉片病斑更大,火山狀病斑裂痕更明顯,同時病斑只會出現在果皮上,嚴重發(fā)生時會造成早期落果[4]。該病原菌適宜高溫高濕環(huán)境,以秋梢為媒介越冬。濕溫環(huán)境下借助風雨、枝葉接觸和昆蟲傳播,潛伏期一般在3～10d,因品種而異。尤其每年臺風、暴雨過后柑桔潰瘍病大范圍發(fā)生。

該病在我國大部分的柑桔主要產區(qū)都很常見,其中屬廣西、廣東、云南、湖南、江蘇、浙江、福建等省產區(qū)嚴重受其威脅[5]。一旦被侵染,引發(fā)潰瘍病,蔓延速度極快,發(fā)病嚴重的會造成落葉、落果,還會導致柑桔樹枯死等。隨著柑桔種植范圍擴大,潰瘍病的發(fā)生面積也增加,并對柑桔種植業(yè)構成極大威脅,危害嚴重。對于柑桔潰瘍病的防治,大部分種植區(qū)都是以化學防治為主,以控梢等栽培措施為輔?；瘜W防治作為農業(yè)生產中使用最多最廣的一種手段,其作用效果毋庸置疑,但銅制劑作為防治潰瘍病的首選藥劑,長時間使用帶給環(huán)境的危害也是不容忽視的。合理減少銅制劑的使用量已刻不容緩,以此不僅可以減少對生態(tài)的危害,還可以給農戶降低成本增加收益。因此銅制劑替代藥劑的研發(fā)與利用,為柑橘潰瘍病的防治提供了更多可能。

中生菌素(zhongshengmycin)作為具有較廣殺菌譜的保護性農用抗生素,是淺灰色鏈霉菌海南變種(Streptomyceslavendulaevarheinanensisn.var)的代謝產物[6]。此抗生素通過抑制病原菌體生長繁殖來達到抑菌的效果,并兼顧對農作物病害、昆蟲、雜草等能起到抑制甚至殺死的功效。與此同時,中生菌素對植物細菌性病害的抑制作用成為替代銅制劑來防治柑桔潰瘍病已初見成效。據報道,吳曉金等[7]在篩選對柑橘潰瘍病菌有強烈抑制作用的化學藥劑試驗中,發(fā)現3%中生菌素可濕性粉劑對病菌有一定的抑制效果,其中EC50為162.89μg/mL。劉丹丹等[8]應用渾濁度法測定藥劑對柑桔潰瘍病原菌的毒力,利用回歸分析獲得毒力方程表明12%中生菌素可濕性粉劑對病原菌的抑制中濃度為3.01μg/mL。中生菌素的施用對防治病原菌有優(yōu)勢,又能降低對環(huán)境的破壞,減輕藥劑對食品健康等方面的不良影響。但中生菌素單一大量使用也存在弊端,容易使病原菌產生抗藥性,將中生菌素與作用機理存在差異的藥劑進行復配可減少用藥量還能擴大防治范圍,并延緩抗性的發(fā)展,此措施也是農業(yè)中常見的一種。筆者研究了生物農藥復配后對柑桔潰瘍病菌協(xié)同毒力效果,避開了以化學農藥為主要防治措施的局限性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 柑桔潰瘍病原菌分離自四川省樂山市犍為縣玉津鎮(zhèn)柑桔基地(103°99′10″E,29°11′11″N)的柑桔病葉。無菌條件下用無菌水浸泡柑桔病葉,并反復沖洗3次,用紗布擦去多余水分。將擦干的葉片放入70%～75%乙醇浸泡3min,無菌水沖洗4～5次[9],再放入0.5%～1%次氯酸鈉消毒1～2min,無菌水沖洗4～5次,用紗布擦去多余水分。將有潰瘍病斑的病害處剪成4m×4mm小塊于培養(yǎng)皿中,在小塊葉片上加2滴無菌水,用玻璃棒研磨,至無菌水變色,形成菌液(此操作所接觸的所有器皿及工具均需滅菌后使用)。采用平板劃線法用無菌針蘸取菌液直接在牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基上劃線,并多次轉接單菌落反復純化,得到有金屬光澤的蠟黃色單菌落。在溫室內接種到健康的柑桔葉片上,加溫加濕條件下葉片上出現潰瘍病斑,從而得出結論所分離的菌種為柑桔潰瘍病菌。將反復純化的菌種轉接到斜面上,28℃培養(yǎng)48～72 h后置于冰箱保存,備用。

1.1.2 試驗藥劑 供試藥劑38%中生菌素原藥,由陜西麥可羅生物科技有限公司生產提供。復配藥劑79.2%春雷霉素原藥,由陜西麥可羅生物科技有限公司生產提供。試驗在陜西麥可羅生物科技有限公司國家農藥監(jiān)測中心工程中心生測實驗室進行。

1.1.3 試驗培養(yǎng)基 牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基)：蛋白胨5g,酵母粉1g,牛肉浸膏3g,瓊脂17g,水1000mL,pH為7.0,121℃高壓蒸汽滅菌30min。

1.2 試驗方法

1.2.1 2種單劑對柑桔潰瘍病菌的毒力測定 采用平板抑菌圈法進行試驗測定[10]。中生菌素和春雷霉素原藥稱取一定質量的樣品,分別配制成1000μg/mL的母液,于4℃下低溫保存待用,試驗前用無菌水分別稀釋成一系列濃度。先把冰箱備用的柑桔潰瘍病菌用無菌水配置成1×109CFU/mL菌懸液,然后將1mL菌懸液加入到冷卻至45～50℃的100mL培養(yǎng)基中混勻倒平板,放置20min左右,制成菌平板。取滅菌的6mm濾紙圓片置于各稀釋好的藥液中浸泡10min,而后靠容器內壁停滯片刻,轉移到菌平板中心處[11]。每種藥劑不同濃度重復4次。將放有濾紙片的平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24～48 h測定抑菌圈直徑,采用“十字交叉法”垂直測量。藥劑對柑桔潰瘍病菌的生長抑制率計算公式：抑制率(%)=[(處理組抑制圈直徑-對照組抑制圈直徑)/處理組抑制圈直徑]×100%。

以供試藥劑濃度的對數值為x軸,抑制率的幾率值為y軸[12-13],依據兩者間的線性關系計算毒力回歸方程y=ax+b,并根據回歸直線計算相關系數r及EC50、EC90值。

1.2.2 復配藥劑的聯合毒力測定 在上述1.2.1單劑毒力測定的基礎之上,中生菌素與春雷霉素按體積比1：1、1：2、2：1、2：3、2：5、3：1、3：2、3：5、5：2和5：3共10個不同配比來測定二元復配藥劑對柑桔潰瘍病菌的抑制率,復配藥劑的終濃度見表1。

表1 不同殺菌劑單劑及復配藥劑的濃度

采用混劑共毒系數法(co-toxicitycoefficient,CTC),以CTC值的大小來評判二元復配藥劑的聯合毒力作用。共毒系數的計算公式如下：

首先通過實驗及軟件進行數據分析,得出測試藥劑的毒力方程、EC50、EC90以及95%置信限,進而計算毒力系數：

理論毒力指數(TTI)=a的毒力指數×a在混劑中的含量(%)+b的毒力指數×b在混集中的含量(%)

式中：EC50為中生菌素單劑或春雷霉素單劑或二者混配的實測有效抑制中濃度,μg/mL;a為中生菌素單劑;b為春雷霉素單劑。

混劑的共毒系數(CTC)值在小于80時,判定為二者拮抗作用;在80～120之間時,判定為相加作用;在大于120時,判定為增效作用[14];大于200時,為明顯的增效作用。

2 結果與分析

中生菌素單劑對柑桔潰瘍病菌的抑制中濃度較春雷霉素單劑防效具有優(yōu)勢,其中中生菌素EC50在41.3179μg/mL,春雷霉素EC50在63.9440μg/mL。但在兩者復配情況下春雷霉素表現的更具有優(yōu)勢,隨著春雷霉素的增加,EC50降低,藥劑敏感度增強,而中生菌素表現正好相反。從表2可見,兩者大部分復配組合物均具有相加作用;當中生菌素與春雷霉素按體積比2：1、3：1、5：2復配時,兩者具有拮抗作用,共毒系數分別為73.86、76.32、75.48,在農業(yè)生產中不宜采用此復配比例;當中生菌素和春雷霉素體積比2：5復配時,共毒系數最大,為126.99,表明兩者復配具有增效作用。因此,中生菌素與春雷霉素復配可有效防治柑桔潰瘍病菌,可替代銅制劑等化學藥劑,為田間柑桔潰瘍病菌的化學制劑抗藥性治理奠定良好的基礎。

表2 復配藥劑對柑桔潰瘍病菌的毒力比較

3 討論

柑桔潰瘍病是世界范圍的檢疫病害,1999年陳靈敏等[15]報道防治柑橘潰瘍病藥劑以波爾多液防效最佳,防效在94.91%,其次47%加瑞農可濕性粉劑、綠乳銅和消病靈,防效分別在90.39%、77.70%和72.80%,表明殺菌劑中防治潰瘍病以銅制劑較為有效。后期銅制劑的大量、大范圍使用增強了病原菌的抗藥性,同時隨著最后一個農用鏈霉素登記證件到期,不再續(xù)展,市場份額被其他細菌性防治藥劑替代占據,因此生物安全性新藥劑的研發(fā)與應用有一定必要性。孫慧敏等[16]試驗結果表明,6%大蒜素EC對潰瘍病具有較好防效,并可作為防治潰瘍病生產有機或綠色臍橙使用。宋曉兵等[17]研究了25%春雷霉素·葉枯唑新型復配藥劑對柑桔潰瘍病菌的防效及對柑桔的安全性,結果表現為25%春雷霉素·葉枯唑對柑桔潰瘍病田間防治效果能達到80%以上。Luana等[18]研究了查爾酮BC1和T9A對柑桔潰瘍病菌的抑菌活性,結果顯示BC1和T9A在20～40μg/mL濃度范圍內可有效抑制病原菌活性。應用過程中,藥劑應擇優(yōu)輪換使用,降低耐藥性;或選擇施用適宜的復配制劑,即可有效延緩病害對藥劑的抗性發(fā)生,擴大抗菌譜,還有助于打造生態(tài)友好化發(fā)展趨勢;也可以在藥劑中加入助劑,具有減少用藥量、增強藥效以及延緩抗藥性的產生等優(yōu)點[19]。此外,種植戶要有意識地樹立起科學種植的意識,對防治措施嚴加把控,保障柑桔的產量與品質,從而實現增產增收目標[20]。

4 結論

殺菌劑復配表現的聯合毒力作用分為3種,分別是增效、相加與拮抗作用,實際生產上會更傾向于具有增效作用的殺菌劑配比比例進行復配。本試驗表明,選用春雷霉素與中生菌素進行復配,春雷霉素是一種小金色放線菌所產生的農用抗生素,醫(yī)農兼用菌劑,有預防和防治雙重作用,具有較強的內吸性、滲透性,高效、廣譜、低毒的優(yōu)點,兩者復配防效多表現為相加或增效作用,增強了中生菌素對柑橘潰瘍病菌的生物活性。因此將中生菌素與春雷霉素進行復配協(xié)同防治柑桔潰瘍病菌是可行的,為下一步田間試驗奠定基礎。但田間具體防效仍需進一步的試驗進行驗證,同時復配藥劑的田間使用防治技術還待進一步探究。