李雙雙,潘忠成,2*,張心心,潘子瑜,鄭鵬飛,李金峰

(1.陜西麥可羅生物科技有限公司,陜西 渭南 714200;2.哈爾濱工程大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院教育部超輕材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150001;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,哈爾濱 150001 )

柑桔潰瘍病(CitrusBacterialCankerDisease,CBCD)是由地毯黃單胞桿菌(Xanthomonasaxonopodispv.Citri.Xac)柑桔致病變種引起的危害全球柑桔的重要作物病害,是國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)檢疫對(duì)象[1-2]。該病害對(duì)柑桔作物造成的危害極大,感染的程度會(huì)因物種的不同和品種的差異以及栽培管理措施和氣候條件等存在差異。柑桔潰瘍病菌與與其他許多細(xì)菌性病害類似,其病原菌借助風(fēng)雨、昆蟲、修剪工具等從傷口、氣孔等侵入植株[1]。病菌的寄主范圍較廣泛,主要對(duì)蕓香科植物進(jìn)行侵染,嚴(yán)重為害柑桔的葉、枝干及果實(shí),引起葉片、枝干枝條及果實(shí)發(fā)生潰瘍斑,嚴(yán)重影響作物的正常長(zhǎng)勢(shì),產(chǎn)品品質(zhì)及產(chǎn)量的下降,對(duì)柑桔作物生產(chǎn)影響重大[3]。病害侵染,葉背開始現(xiàn)類黃色極小油漬斑點(diǎn),而后正背兩面隆起圓形黃米色病斑,表皮出現(xiàn)裂痕,粗糙木質(zhì)化,病部凹陷有黃色暈環(huán)出現(xiàn)。枝梢病斑較葉片病斑更加凸起,病部凹陷但無(wú)暈環(huán),嚴(yán)重時(shí)葉枯枝枯,其中夏梢最嚴(yán)重。果實(shí)病斑較葉片病斑更大,火山狀病斑裂痕更明顯,同時(shí)病斑只會(huì)出現(xiàn)在果皮上,嚴(yán)重發(fā)生時(shí)會(huì)造成早期落果[4]。該病原菌適宜高溫高濕環(huán)境,以秋梢為媒介越冬。濕溫環(huán)境下借助風(fēng)雨、枝葉接觸和昆蟲傳播,潛伏期一般在3～10d,因品種而異。尤其每年臺(tái)風(fēng)、暴雨過(guò)后柑桔潰瘍病大范圍發(fā)生。

該病在我國(guó)大部分的柑桔主要產(chǎn)區(qū)都很常見,其中屬?gòu)V西、廣東、云南、湖南、江蘇、浙江、福建等省產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重受其威脅[5]。一旦被侵染,引發(fā)潰瘍病,蔓延速度極快,發(fā)病嚴(yán)重的會(huì)造成落葉、落果,還會(huì)導(dǎo)致柑桔樹枯死等。隨著柑桔種植范圍擴(kuò)大,潰瘍病的發(fā)生面積也增加,并對(duì)柑桔種植業(yè)構(gòu)成極大威脅,危害嚴(yán)重。對(duì)于柑桔潰瘍病的防治,大部分種植區(qū)都是以化學(xué)防治為主,以控梢等栽培措施為輔?；瘜W(xué)防治作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用最多最廣的一種手段,其作用效果毋庸置疑,但銅制劑作為防治潰瘍病的首選藥劑,長(zhǎng)時(shí)間使用帶給環(huán)境的危害也是不容忽視的。合理減少銅制劑的使用量已刻不容緩,以此不僅可以減少對(duì)生態(tài)的危害,還可以給農(nóng)戶降低成本增加收益。因此銅制劑替代藥劑的研發(fā)與利用,為柑橘潰瘍病的防治提供了更多可能。

中生菌素(zhongshengmycin)作為具有較廣殺菌譜的保護(hù)性農(nóng)用抗生素,是淺灰色鏈霉菌海南變種(Streptomyceslavendulaevarheinanensisn.var)的代謝產(chǎn)物[6]。此抗生素通過(guò)抑制病原菌體生長(zhǎng)繁殖來(lái)達(dá)到抑菌的效果,并兼顧對(duì)農(nóng)作物病害、昆蟲、雜草等能起到抑制甚至殺死的功效。與此同時(shí),中生菌素對(duì)植物細(xì)菌性病害的抑制作用成為替代銅制劑來(lái)防治柑桔潰瘍病已初見成效。據(jù)報(bào)道,吳曉金等[7]在篩選對(duì)柑橘潰瘍病菌有強(qiáng)烈抑制作用的化學(xué)藥劑試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)3%中生菌素可濕性粉劑對(duì)病菌有一定的抑制效果,其中EC50為162.89μg/mL。劉丹丹等[8]應(yīng)用渾濁度法測(cè)定藥劑對(duì)柑桔潰瘍病原菌的毒力,利用回歸分析獲得毒力方程表明12%中生菌素可濕性粉劑對(duì)病原菌的抑制中濃度為3.01μg/mL。中生菌素的施用對(duì)防治病原菌有優(yōu)勢(shì),又能降低對(duì)環(huán)境的破壞,減輕藥劑對(duì)食品健康等方面的不良影響。但中生菌素單一大量使用也存在弊端,容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性,將中生菌素與作用機(jī)理存在差異的藥劑進(jìn)行復(fù)配可減少用藥量還能擴(kuò)大防治范圍,并延緩抗性的發(fā)展,此措施也是農(nóng)業(yè)中常見的一種。筆者研究了生物農(nóng)藥復(fù)配后對(duì)柑桔潰瘍病菌協(xié)同毒力效果,避開了以化學(xué)農(nóng)藥為主要防治措施的局限性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 柑桔潰瘍病原菌分離自四川省樂(lè)山市犍為縣玉津鎮(zhèn)柑桔基地(103°99′10″E,29°11′11″N)的柑桔病葉。無(wú)菌條件下用無(wú)菌水浸泡柑桔病葉,并反復(fù)沖洗3次,用紗布擦去多余水分。將擦干的葉片放入70%～75%乙醇浸泡3min,無(wú)菌水沖洗4～5次[9],再放入0.5%～1%次氯酸鈉消毒1～2min,無(wú)菌水沖洗4～5次,用紗布擦去多余水分。將有潰瘍病斑的病害處剪成4m×4mm小塊于培養(yǎng)皿中,在小塊葉片上加2滴無(wú)菌水,用玻璃棒研磨,至無(wú)菌水變色,形成菌液(此操作所接觸的所有器皿及工具均需滅菌后使用)。采用平板劃線法用無(wú)菌針蘸取菌液直接在牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基上劃線,并多次轉(zhuǎn)接單菌落反復(fù)純化,得到有金屬光澤的蠟黃色單菌落。在溫室內(nèi)接種到健康的柑桔葉片上,加溫加濕條件下葉片上出現(xiàn)潰瘍病斑,從而得出結(jié)論所分離的菌種為柑桔潰瘍病菌。將反復(fù)純化的菌種轉(zhuǎn)接到斜面上,28℃培養(yǎng)48～72 h后置于冰箱保存,備用。

1.1.2 試驗(yàn)藥劑 供試藥劑38%中生菌素原藥,由陜西麥可羅生物科技有限公司生產(chǎn)提供。復(fù)配藥劑79.2%春雷霉素原藥,由陜西麥可羅生物科技有限公司生產(chǎn)提供。試驗(yàn)在陜西麥可羅生物科技有限公司國(guó)家農(nóng)藥監(jiān)測(cè)中心工程中心生測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.3 試驗(yàn)培養(yǎng)基 牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基)：蛋白胨5g,酵母粉1g,牛肉浸膏3g,瓊脂17g,水1000mL,pH為7.0,121℃高壓蒸汽滅菌30min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 2種單劑對(duì)柑桔潰瘍病菌的毒力測(cè)定 采用平板抑菌圈法進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定[10]。中生菌素和春雷霉素原藥稱取一定質(zhì)量的樣品,分別配制成1000μg/mL的母液,于4℃下低溫保存待用,試驗(yàn)前用無(wú)菌水分別稀釋成一系列濃度。先把冰箱備用的柑桔潰瘍病菌用無(wú)菌水配置成1×109CFU/mL菌懸液,然后將1mL菌懸液加入到冷卻至45～50℃的100mL培養(yǎng)基中混勻倒平板,放置20min左右,制成菌平板。取滅菌的6mm濾紙圓片置于各稀釋好的藥液中浸泡10min,而后靠容器內(nèi)壁停滯片刻,轉(zhuǎn)移到菌平板中心處[11]。每種藥劑不同濃度重復(fù)4次。將放有濾紙片的平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24～48 h測(cè)定抑菌圈直徑,采用“十字交叉法”垂直測(cè)量。藥劑對(duì)柑桔潰瘍病菌的生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式：抑制率(%)=[(處理組抑制圈直徑-對(duì)照組抑制圈直徑)/處理組抑制圈直徑]×100%。

以供試藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為x軸,抑制率的幾率值為y軸[12-13],依據(jù)兩者間的線性關(guān)系計(jì)算毒力回歸方程y=ax+b,并根據(jù)回歸直線計(jì)算相關(guān)系數(shù)r及EC50、EC90值。

1.2.2 復(fù)配藥劑的聯(lián)合毒力測(cè)定 在上述1.2.1單劑毒力測(cè)定的基礎(chǔ)之上,中生菌素與春雷霉素按體積比1：1、1：2、2：1、2：3、2：5、3：1、3：2、3：5、5：2和5：3共10個(gè)不同配比來(lái)測(cè)定二元復(fù)配藥劑對(duì)柑桔潰瘍病菌的抑制率,復(fù)配藥劑的終濃度見表1。

表1 不同殺菌劑單劑及復(fù)配藥劑的濃度

采用混劑共毒系數(shù)法(co-toxicitycoefficient,CTC),以CTC值的大小來(lái)評(píng)判二元復(fù)配藥劑的聯(lián)合毒力作用。共毒系數(shù)的計(jì)算公式如下：

首先通過(guò)實(shí)驗(yàn)及軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得出測(cè)試藥劑的毒力方程、EC50、EC90以及95%置信限,進(jìn)而計(jì)算毒力系數(shù)：

理論毒力指數(shù)(TTI)=a的毒力指數(shù)×a在混劑中的含量(%)+b的毒力指數(shù)×b在混集中的含量(%)

式中：EC50為中生菌素單劑或春雷霉素單劑或二者混配的實(shí)測(cè)有效抑制中濃度,μg/mL;a為中生菌素單劑;b為春雷霉素單劑。

混劑的共毒系數(shù)(CTC)值在小于80時(shí),判定為二者拮抗作用;在80～120之間時(shí),判定為相加作用;在大于120時(shí),判定為增效作用[14];大于200時(shí),為明顯的增效作用。

2 結(jié)果與分析

中生菌素單劑對(duì)柑桔潰瘍病菌的抑制中濃度較春雷霉素單劑防效具有優(yōu)勢(shì),其中中生菌素EC50在41.3179μg/mL,春雷霉素EC50在63.9440μg/mL。但在兩者復(fù)配情況下春雷霉素表現(xiàn)的更具有優(yōu)勢(shì),隨著春雷霉素的增加,EC50降低,藥劑敏感度增強(qiáng),而中生菌素表現(xiàn)正好相反。從表2可見,兩者大部分復(fù)配組合物均具有相加作用;當(dāng)中生菌素與春雷霉素按體積比2：1、3：1、5：2復(fù)配時(shí),兩者具有拮抗作用,共毒系數(shù)分別為73.86、76.32、75.48,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不宜采用此復(fù)配比例;當(dāng)中生菌素和春雷霉素體積比2：5復(fù)配時(shí),共毒系數(shù)最大,為126.99,表明兩者復(fù)配具有增效作用。因此,中生菌素與春雷霉素復(fù)配可有效防治柑桔潰瘍病菌,可替代銅制劑等化學(xué)藥劑,為田間柑桔潰瘍病菌的化學(xué)制劑抗藥性治理奠定良好的基礎(chǔ)。

表2 復(fù)配藥劑對(duì)柑桔潰瘍病菌的毒力比較

3 討論

柑桔潰瘍病是世界范圍的檢疫病害,1999年陳靈敏等[15]報(bào)道防治柑橘潰瘍病藥劑以波爾多液防效最佳,防效在94.91%,其次47%加瑞農(nóng)可濕性粉劑、綠乳銅和消病靈,防效分別在90.39%、77.70%和72.80%,表明殺菌劑中防治潰瘍病以銅制劑較為有效。后期銅制劑的大量、大范圍使用增強(qiáng)了病原菌的抗藥性,同時(shí)隨著最后一個(gè)農(nóng)用鏈霉素登記證件到期,不再續(xù)展,市場(chǎng)份額被其他細(xì)菌性防治藥劑替代占據(jù),因此生物安全性新藥劑的研發(fā)與應(yīng)用有一定必要性。孫慧敏等[16]試驗(yàn)結(jié)果表明,6%大蒜素EC對(duì)潰瘍病具有較好防效,并可作為防治潰瘍病生產(chǎn)有機(jī)或綠色臍橙使用。宋曉兵等[17]研究了25%春雷霉素·葉枯唑新型復(fù)配藥劑對(duì)柑桔潰瘍病菌的防效及對(duì)柑桔的安全性,結(jié)果表現(xiàn)為25%春雷霉素·葉枯唑?qū)Ω探蹪儾√镩g防治效果能達(dá)到80%以上。Luana等[18]研究了查爾酮BC1和T9A對(duì)柑桔潰瘍病菌的抑菌活性,結(jié)果顯示BC1和T9A在20～40μg/mL濃度范圍內(nèi)可有效抑制病原菌活性。應(yīng)用過(guò)程中,藥劑應(yīng)擇優(yōu)輪換使用,降低耐藥性;或選擇施用適宜的復(fù)配制劑,即可有效延緩病害對(duì)藥劑的抗性發(fā)生,擴(kuò)大抗菌譜,還有助于打造生態(tài)友好化發(fā)展趨勢(shì);也可以在藥劑中加入助劑,具有減少用藥量、增強(qiáng)藥效以及延緩抗藥性的產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)[19]。此外,種植戶要有意識(shí)地樹立起科學(xué)種植的意識(shí),對(duì)防治措施嚴(yán)加把控,保障柑桔的產(chǎn)量與品質(zhì),從而實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)增收目標(biāo)[20]。

4 結(jié)論

殺菌劑復(fù)配表現(xiàn)的聯(lián)合毒力作用分為3種,分別是增效、相加與拮抗作用,實(shí)際生產(chǎn)上會(huì)更傾向于具有增效作用的殺菌劑配比比例進(jìn)行復(fù)配。本試驗(yàn)表明,選用春雷霉素與中生菌素進(jìn)行復(fù)配,春雷霉素是一種小金色放線菌所產(chǎn)生的農(nóng)用抗生素,醫(yī)農(nóng)兼用菌劑,有預(yù)防和防治雙重作用,具有較強(qiáng)的內(nèi)吸性、滲透性,高效、廣譜、低毒的優(yōu)點(diǎn),兩者復(fù)配防效多表現(xiàn)為相加或增效作用,增強(qiáng)了中生菌素對(duì)柑橘潰瘍病菌的生物活性。因此將中生菌素與春雷霉素進(jìn)行復(fù)配協(xié)同防治柑桔潰瘍病菌是可行的,為下一步田間試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。但田間具體防效仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)復(fù)配藥劑的田間使用防治技術(shù)還待進(jìn)一步探究。