張 瑞,楊 倩,柯文才,黃新梅,吳躍躍,李 悅,臧淑妃,劉 軍

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,上海 200240

妊娠期糖尿病(GDM)是指妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖代謝異常,其屬于高危妊娠疾病,是女性妊娠期較為常見的并發(fā)癥之一[1-2]。隨著生活水平的提高,人們形成不良的飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣,GDM在我國的發(fā)病率也隨之升高,且發(fā)病人群趨向年輕化[3]。GDM對母體及胎兒都有較大危害,如造成胎兒窘迫、羊水過多等,嚴(yán)重情況下甚至造成流產(chǎn)或死胎[4-5]。此外,GDM患者產(chǎn)后為糖尿病高發(fā)人群,若GDM患者未得到有效干預(yù)而分娩出巨大兒,則新生兒成年后發(fā)生高血壓、糖尿病及肥胖風(fēng)險極高。目前,對GDM的發(fā)病機(jī)制仍然不明確,因此,探討GDM的發(fā)病機(jī)制,并實施有效干預(yù),對于改善GDM孕婦的產(chǎn)后結(jié)局及子代的后續(xù)生長發(fā)育有重要的臨床意義。SLC16A1基因表達(dá)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCT)的第1個成員為單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MCT1),MCT1主要參與細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)酮體、乳酸、丙酮酸等代謝產(chǎn)物,在全身組織普遍表達(dá),正常胎盤MCT1表達(dá)量較多[6-7]。目前,關(guān)于胎盤MCT1在GDM發(fā)病機(jī)制中作用的相關(guān)研究較少。鑒于此,本研究分析了胎盤SLC16A1基因及MCT1表達(dá)量與GDM的關(guān)系,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院GDM管理中心的1 361例妊娠女性為研究對象,其中281例GDM患者納入GDM組,1 080例健康妊娠女性納入正常妊娠組。GDM診斷標(biāo)準(zhǔn):所有研究對象在妊娠24～28周進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(OGTT),OGTT前至少禁食8 h,空腹血糖(FPG)≥5.1 mmol/L,或餐后1 h血糖(1 h BG)≥10.0 mmol/L,或餐后2 h血糖(2 h BG)≥8.5 mmol/L診斷為GDM。所有研究對象均排除貧血、腫瘤、病毒性肝病、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、感染病史和近期使用鐵劑治療史,近期有獻(xiàn)血、輸血史,以及有嚴(yán)重吸煙和酗酒史。本研究為病例對照研究,胎盤組織來源為本科室既往GDM相關(guān)研究留取的生物樣本庫(倫理號:2016081),使用患者臨床數(shù)據(jù)經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過(倫理號:2019070)。

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本檢測結(jié)果及一般病史采集 收集所有研究對象的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、收縮壓、舒張壓、生育史、GDM家族史、血常規(guī)指標(biāo)、血肌酐(Scr)、FPG、1 h BG、糖化血紅蛋白(HbA1c)、2 h BG、甘油三酯 (TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹胰島素(FINS)、生產(chǎn)時孕周、是否生產(chǎn)巨大兒等信息。采用穩(wěn)態(tài)模式評估法評估胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β):HOMA-IR=FPG×FINS/22.5;HOMA-β=FINS×20/(FPG—3.5)。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測SLC16A1基因表達(dá)量 胎盤組織來源為本科室既往留取的生物樣本庫,根據(jù)臨床信息匹配相關(guān)胎盤組織,胎盤在液氮中保存,使用Trizol (Takara Bio Inc,9109) 提取總 RNA,并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Takara Bio Inc,RR036A) 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。使用RT-qPCR試劑盒(Takara Bio Inc,DRR041A),通過Biosystems 7500 RT-qPCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增,并將SLC16A1基因的mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化為同一樣品的GAPDH水平。步驟如下:(1)Trziol提取總RNA;(2)采用DEPC 水溶解RNA,調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀,檢測濃度;(3)預(yù)先準(zhǔn)備聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)管,加入反轉(zhuǎn)錄混合物,然后加入RNA,準(zhǔn)備好PCR儀,放入標(biāo)本,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;(4)預(yù)先訂購目標(biāo)基因及內(nèi)參基因的引物,然后參考RT-qPCR試劑盒說明書的擴(kuò)增程序,進(jìn)行cDNA擴(kuò)增;(5)收集目標(biāo)基因及內(nèi)參基因的擴(kuò)增CD值,最后用2-ΔΔCt法分析SLC16A1基因的cDNA水平,以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.3采用蛋白質(zhì)免疫印跡法分析兩組胎盤MCT1的表達(dá)量 稱取每種組織樣品0.1 g,將組織塊在冰上研磨,混勻后冰上孵育30 min,4 ℃,12 000 r/mim離心15 min,取上清液備用。每種樣品上樣20 μL,電泳及轉(zhuǎn)膜后,將膜放置于30 mL封閉緩沖液中(1×TBST中加入5%脫脂奶粉),室溫下置于搖床振蕩1 h。MCT1及GAPDH一抗(Abcam,UK)反應(yīng):按推薦的稀釋比(通常1∶1 000)配制一抗,將膜浸于一抗中室溫下?lián)u床孵育2 h;洗膜4次,每次10 min;二抗(Abcam,UK)反應(yīng):按1∶5 000的稀釋比配制二抗,將膜于室溫下?lián)u床孵育1 h;洗膜4次,每次10 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)反應(yīng):把膜用ECL試劑處理,顯影曝光。掃描曝光的X線片。

2 結(jié) 果

2.1兩組基線資料及臨床指標(biāo)比較 匹配前,GDM組年齡、孕前BMI、既往有GDM病史患者比例均明顯高于正常妊娠組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);匹配前,GDM組已生育比例小于正常妊娠組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。匹配后,兩組年齡、孕前BMI及生育史、既往有GDM病史患者比例比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組匹配前及匹配后孕前的基線資料比較或n(%)]

匹配前,GDM組第1妊娠期白細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)均明顯高于正常妊娠組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。匹配后,兩組收縮壓、舒張壓、白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)等臨床指標(biāo)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組匹配前及匹配后第1妊娠期臨床指標(biāo)比較或M(P25,P75)]

匹配前,GDM組第2妊娠期FPG、1 h BG、2 h BG、HbA1c、TG、HDL-C水平均明顯高于正常妊娠組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。匹配后,GDM組第2妊娠期FPG、1 h BG、2 h BG、HbA1c、TG水平仍高于正常妊娠組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組匹配前及匹配后第2妊娠期臨床指標(biāo)比較[M(P25,P75)或

匹配前,GDM組生產(chǎn)時孕周小于正常妊娠組,胎兒體質(zhì)量明顯大于正常妊娠組,生產(chǎn)巨大兒比例明顯高于正常妊娠組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。匹配后,GDM組生產(chǎn)巨大兒比例仍高于正常妊娠組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組匹配前及匹配后妊娠結(jié)局比較或n(%)]

續(xù)表4 兩組匹配前及匹配后妊娠結(jié)局比較或n(%)]

2.2兩組間SLC16A1基因及MCT1表達(dá)量比較 匹配后,GDM組、正常妊娠組SLC16A1基因表達(dá)量分別為0.390(0.006,2.980)、0.561(0.014,4.205),GDM組明顯低于正常妊娠組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。匹配后,GDM組、正常妊娠組MCT1表達(dá)量分別為0.097±0.044、0.166±0.030,GDM組明顯低于正常妊娠組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。GDM組較正常妊娠組MCT1表達(dá)量下降40%左右,GDM組較正常妊娠組SLC16A1基因表達(dá)量下降30%左右。

圖1 GDM組與正常妊娠組MCT1蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果

2.3Logistic回歸分析SLC16A1基因?qū)DM的影響 Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),從單獨(dú)SLC16A1基因進(jìn)入模型[模型1:OR為0.764(0.648～0.902),P=0.001],到逐步校正TG[模型2:OR為0.740(0.561～0.974),P=0.032],SLC16A1基因表達(dá)量增加都表現(xiàn)為GDM的保護(hù)因素。見表5。SLC16A1基因聯(lián)合TG對GDM的預(yù)測模型的曲線下面積(AUC)為0.749(P<0.001)。見圖2。

表5 在匹配人群中用Logistic回歸分析確定SLC16A1基因?qū)θ焉锾悄虿〉挠绊?/p>

圖2 SLC16A1基因表達(dá)量聯(lián)合TG對GDM的預(yù)測能力

3 討 論

GDM是妊娠期女性常發(fā)生的一種代謝紊亂疾病,在過去的幾十年里,GDM的患病率逐步上升[8-11]。研究數(shù)據(jù)顯示,中國GDM的流行率為9.3%～18.9%[12]。GDM給母體及胎兒帶來危害巨大[13-17],因此,研究GDM發(fā)病機(jī)制的必要性越來越迫切。一些傳統(tǒng)的因素,包括糖尿病家族史或個人史、既往不良妊娠結(jié)局史、肥胖與GDM相關(guān),然而GDM的確切病理、生理機(jī)制仍不清楚,但胎盤在其發(fā)病機(jī)制中起到了很大的作用[18]。本研究旨在探討胎盤SLC16A1基因表達(dá)量及其表達(dá)的蛋白MCT1與GDM之間的關(guān)系,為研究胎盤在GDM發(fā)病機(jī)制中的作用提供思路。

匹配前,GDM組年齡、孕前BMI、既往有GDM病史患者比例均明顯高于正常妊娠組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),該結(jié)果與既往研究一致[14,18],再次驗證高齡、孕前肥胖及既往有GDM病史都是GDM的高危人群,臨床上需要對于該類人群進(jìn)行及時篩查,盡早干預(yù),尤其是針對孕前BMI過高孕婦,在孕前咨詢時應(yīng)及時予以減重干預(yù),可減少孕期GDM發(fā)病風(fēng)險。

本研究通過GDM組同正常妊娠組1∶1匹配后,年齡、BMI、GDM病史、生產(chǎn)史等傳統(tǒng)危險因素得到矯正,發(fā)現(xiàn)FPG、1 h BG、2 h BG、HbA1c、TG和SLC16A1基因表達(dá)量在兩組間仍然存在差異,進(jìn)一步進(jìn)行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),SLC16A1基因表達(dá)量增加是GDM相對穩(wěn)定的保護(hù)因素。SLC16A1基因表達(dá)量同TG聯(lián)合后預(yù)測GDM的AUC達(dá)0.749,有良好的預(yù)測價值。

目前關(guān)于MCT1的研究主要集中在腫瘤相關(guān)研究中,研究表明MCT1對于單羧酸化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)在腫瘤細(xì)胞的能量代謝中起重要作用[19]。也有研究表明MCT1可能參與了代謝性相關(guān)疾病的發(fā)病,目前具體機(jī)制尚未完全闡明[20]。但目前關(guān)于GDM與MCT1或SLC16A1基因的相關(guān)研究較少,本研究發(fā)現(xiàn)GDM組SLC16A1基因及MCT1表達(dá)量均降低,表明該胎盤蛋白可能通過調(diào)節(jié)單碳化合物入胞或出胞而在GDM發(fā)病及不良妊娠結(jié)局中發(fā)揮了重要作用。有動物研究表明,SLC16A1基因表達(dá)量有性別差異,雌性大鼠肝臟的SLC16A1基因表達(dá)量較雄性大鼠下降,具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步探討[21]。

本研究結(jié)果提示GDM患者可能存在更高水平的TG,因此,臨床上應(yīng)更加密切監(jiān)測TG,可避免過高的TG水平引發(fā)胰腺炎。

綜上所述,GDM組的SLC16A1基因及MCT1表達(dá)量均較正常妊娠組下降,SLC16A1基因表達(dá)量增加是GDM的保護(hù)因素。但本研究僅為橫斷面研究,不同SLC16A1基因及MCT1表達(dá)量的母體和胎兒的結(jié)局仍需進(jìn)行隊列研究進(jìn)一步探討,同時GDM患者胎盤SLC16A1基因及其表達(dá)的蛋白MCT1表達(dá)量下降的具體機(jī)制也需要更深入的探討。