李 麗,馮 旭,賀付蒙,馮珊珊,李鳳蘭,胡寶忠,2,徐永清

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030; 2.哈爾濱學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150086)

擴(kuò)展蛋白(expansin)是一類具有非水解活性的細(xì)胞壁松弛蛋白,于1992年由Mcqueen等在黃瓜(Cucumissativus)的下胚軸中首次被發(fā)現(xiàn)[1-2]。植物擴(kuò)展蛋白可分為EXPA、EXPB、EXLA和EXLB四個(gè)亞家族,由信號肽、結(jié)合區(qū)和催化區(qū)組成[3]。研究表明,擴(kuò)展蛋白不僅參與植物的發(fā)育進(jìn)程(細(xì)胞生長、組織分化、根毛發(fā)生、花粉管伸長、果實(shí)軟化等[4-6]),而且也參與植物對干旱、低溫等逆境脅迫響應(yīng)過程,如低溫脅迫下,西葫蘆(Cucurbita pepo)和矮牽牛(Petunia hybrida)中擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá)量顯著增加[7-8];大麥(Hordeum vulgare)中擴(kuò)展蛋白基因HvEXPB7受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá),以促進(jìn)根毛生長的作用方式提高植株的干旱脅迫耐受性[9];白菜(Brassica rapa)擴(kuò)展蛋白基因BrEXLB1的過表達(dá)植株中,該基因的表達(dá)與營養(yǎng)生長期的耐旱性和光合作用呈正相關(guān)[10]。此外,擴(kuò)展蛋白在植物應(yīng)對鹽、重金屬等脅迫過程中也發(fā)揮著重要功能[11]。

低溫脅迫是影響農(nóng)作物生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一,嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全[12-13]。高抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥2號在極寒條件下可以安全越冬,具有寶貴的抗性基因資源[14]。本課題組前期研究結(jié)果表明,東農(nóng)冬麥2號分蘗節(jié)中TaEXPB7-B基因的表達(dá)受低溫和脫落酸處理誘導(dǎo),且過表達(dá)TaEXPB7-B、TaEXPA8-B/D、TaEXPA7-A/B/D基因均可顯著促進(jìn)擬南芥的生長以及對低溫脅迫的耐受性[15-17]。馮珊珊等[18]從東農(nóng)冬麥2號中克隆了TaEXPA12-A/B/D基因,這3個(gè)基因在干旱、脫落酸、茉莉酸甲酯及水楊酸等處理下均上調(diào)表達(dá),說明其可能參與冬小麥對非生物脅迫的響應(yīng)。

為進(jìn)一步鑒定TaEXPB12-A/B/D基因的功能,以東農(nóng)冬麥2號為試驗(yàn)材料,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,將TaEXPB12-A/B/D三個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中,同時(shí)探討了TaEXPB12-A/B/D基因?qū)τ谥参锷L和低溫耐受性的影響,以期為冬小麥擴(kuò)展蛋白的相關(guān)研究提供新的理論基礎(chǔ),同時(shí)為寒地作物分子育種提供優(yōu)質(zhì)的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)所用小麥材料為高抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥2號,擬南芥材料為Colombia野生型,均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 載體及菌株

植物雙元表達(dá)載體pBI121(CaMV 35S啟動子驅(qū)動,含有Kan抗性)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell購于北京全式金生物有限公司,根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受態(tài)GV3101購于上海唯地生物有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 含HA標(biāo)簽重組PBI121-TaEXPB12-A/B/D表達(dá)載體的構(gòu)建

參考馮珊珊等[18]的方法進(jìn)行TaEXPB12-A/B/D基因的克隆,通過PCR分別在TaEXPB12-A/B/D三個(gè)基因的上游添加XbaI酶切位點(diǎn)和HA標(biāo)簽序列,下游添加BamHI酶切位點(diǎn),所用PCR引物見表1。利用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI對上述PCR產(chǎn)物和pBI121載體進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后用T4連接酶連接,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中,然后送哈爾濱擎科生物公司進(jìn)行測序。

1.3.2 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

分別將含HA標(biāo)簽的pBI121-TaEXPA12-A/B/D三個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101中,對陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定,所用PCR引物見表1。

1.3.3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥,具體參考Feng等[15]的方法進(jìn)行。利用PCR及Western-blot方法分別對陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行鑒定,試驗(yàn)所用PCR引物見表1,Western-blot試驗(yàn)所用抗體為Anti-HA,蛋白質(zhì)提取、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳所用試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司,方法詳見說明書。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的形態(tài)學(xué)觀察

分別將野生型和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子播種于裝有1/2 MS培養(yǎng)基(含50 mg·L-1Kan)的平皿上,在無菌室培養(yǎng)(16 h/8 h光周期,25 ℃/20 ℃晝夜溫度)7 d后,觀察植株根系的生長情況;待擬南芥生長至4葉期時(shí),移栽至營養(yǎng)缽中(營養(yǎng)土∶蛭石=3∶1),培養(yǎng)條件同上,14 d后觀察葉片的生長情況,21 d后觀察并測定株高。將擬南芥種子播種于裝有1/2 MS培養(yǎng)基(含50 mg·L-1Kan)的垂直板上,10 d后觀察側(cè)根的生長情況。

1.3.5 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀察及生理指標(biāo)測定

取在營養(yǎng)體中生長至40 d且長勢一致的擬南芥植株,一部分置于-20℃的環(huán)境中,冷馴化30 min后取出,于正常條件下培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)存活率;一部分置于4℃培養(yǎng)箱中模擬低溫脅迫處理,分別于處理后0、3、6、12、24和48 h對全株進(jìn)行取樣,進(jìn)行生理指標(biāo)的測定,其中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性及丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性糖含量的測定均參照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司所購試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)均至少重復(fù)3次(n≥10),數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,用GraphPad Prism 7 進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 含HA標(biāo)簽重組pBI121-TaEXPA12-A/B/D表達(dá)載體的構(gòu)建

分別在TaEXPB12-A/B/D三個(gè)基因的上游添加XbaI酶切位點(diǎn)和HA標(biāo)簽序列,下游添加BamHI酶切位點(diǎn),PCR結(jié)果如圖1所示。對pBI121表達(dá)載體和上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切并連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后,挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定,陽性菌落的PCR檢測結(jié)果如圖2所示。將測序結(jié)果正確的pBI121-TaEXPA12-A/B/D載體分別轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101中,陽性菌落的PCR鑒定結(jié)果如圖3所示,條帶大小與圖1和圖2一致,表明已成功獲得含有pBI121-TaEXPA12-A/B/D載體的根癌農(nóng)桿菌。

M: DL2000; 1: TaEXPB12-A; 2: TaEXPB12-B; 3: TaEXPB12-D.圖1 TaEXPB12-A/B/D基因添加酶切位點(diǎn)的PCR結(jié)果Fig. 1 PCR results of TaEXPB12-A/B/D genes with the added restriction enzyme sites

M: DL2000; 1: pBI121-TaEXPB12-A; 2: pBI121-TaEXPB12-B; 3: pBI121-TaEXPB12-D.圖2 pBI121-TaEXPB12-A/B/D重組載體的菌落PCR結(jié)果Fig. 2 Colony PCR results of pBI121-TaEXPA12-A/B/D recombinant vectors

M: DL2000; A1 and A2: pBI121-TaEXPB12-A; B1 and B2: pBI121-TaEXPB12-B; D1 and D2: pBI121-TaEXPB12-D.圖3 含有pBI121-TaEXPB12-A/B/D載體農(nóng)桿菌的PCR鑒定結(jié)果Fig. 3 PCR identification results of Agrobacterium containing pBI121-TaEXPB12-A/B/D vectors

2.2 轉(zhuǎn)TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥植株的篩選與鑒定

將野生型和轉(zhuǎn)基因植株T0代的種子播種在含有50 mg·L-1Kan的1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選,結(jié)果如圖4A所示。將陽性植株(T1代)移至營養(yǎng)缽中培養(yǎng),以此模式篩選至T3代植株。對T3代植株分別進(jìn)行PCR和Western-blot,結(jié)果(圖4B和4C)表明,TaEXPB12-A/B/D基因已成功轉(zhuǎn)化至擬南芥的基因組中,且其編碼的蛋白已表達(dá)。

2.3 T3代轉(zhuǎn)TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥的形態(tài)學(xué)分析

對在1/2 MS培養(yǎng)基上生長7 d的擬南芥植株進(jìn)行根部觀察,并測定其根長,結(jié)果(圖5A,5B)顯示,TaEXPB12-A/B/D三個(gè)基因的過表達(dá)顯著促進(jìn)了擬南芥根的伸長和根毛的生長。對在垂直平板上生長10 d的擬南芥植株進(jìn)行側(cè)根觀察,結(jié)果(圖5C)顯示,轉(zhuǎn)TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥的平均側(cè)根數(shù)目分別為39、40和39,約為野生型的2倍。對轉(zhuǎn)TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥的葉片及株高進(jìn)行觀察并測定,結(jié)果(表2)顯示,轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片數(shù)目約為野生型的1.6倍,葉寬約為野生型的1.7倍,差異均達(dá)顯著水平,但轉(zhuǎn)基因擬南芥的株高與野生型無顯著差異。

A:根長;B:根毛形態(tài);C:側(cè)根數(shù)目。A: Root length; B: Root hair morphology; C: Lateral root number.圖5 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長、根毛形態(tài)和側(cè)根數(shù)目比較Fig. 5 Comparisons of root length, root hair morphology and lateral roots number between wild-type and transgenic Arabidopsis

表2 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片數(shù)目、葉寬和株高比較Table 2 Comparisons of leaf number, leaf width, and plant height between wild type and transgenic Arabidopsis

2.4 低溫脅迫對轉(zhuǎn)TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥植株的影響

將野生型和轉(zhuǎn)TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥置于-20℃的環(huán)境中冷馴化30 min后,發(fā)現(xiàn)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均受到了不同程度的傷害,表現(xiàn)為植株葉片萎蔫、顏色加深,但轉(zhuǎn)基因擬南芥受到的傷害略小于野生型。繼續(xù)在正常條件下培養(yǎng)7 d后,野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均恢復(fù)正常生長,轉(zhuǎn)基因TaEXPB12-A/B/D擬南芥的存活率分別為79%、75%和71%,約為野生型的1.8倍(圖6)。這說明TaEXPB12-A/B/D基因的過表達(dá)提高了擬南芥的抗寒能力。

A:表型;B:存活率,**表示轉(zhuǎn)基因植株與野生型的存活率在0.01水平上差異顯著。A: Phenotype; B: Survival rate, ** indicates significant difference of survival rate between wild type and transgenic plants at 0.01 level.圖6 -20 ℃處理下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型和存活率比較Fig. 6 Comparisons of phenotype and survival rate between wild type and transgenic Arabidopsis under -20 ℃ treatment

同時(shí),對野生型和轉(zhuǎn)TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥在4 ℃低溫脅迫下的生理指標(biāo)進(jìn)行測定,結(jié)果(表3)顯示,在4℃處理各時(shí)間點(diǎn),轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)活性均高于野生型,而MDA含量相對較低。其中,轉(zhuǎn)TaEXPB12-A/B/D基因擬南芥的SOD活性在4℃處理0～48 h均顯著高于野生型;POD活性在4℃處理6～24 h均顯著高于野生型;CAT活性在4℃處理3～48 h均顯著高于野生型;MDA含量在4℃處理3 h均顯著低于野生型。植株中Pro和可溶性糖含量測定結(jié)果顯示,在4℃處理各時(shí)間點(diǎn),轉(zhuǎn)基因擬南芥的Pro含量均高于野生型,其中在4 ℃處理0、3、12和48 h差異達(dá)顯著水平;除4 ℃處理0和6 h外的其他時(shí)間點(diǎn),轉(zhuǎn)基因擬南芥的可溶性糖含量均顯著高于野生型。

表3 4℃處理下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥中的生理指標(biāo)Table 3 Physiological indices in wild type and transgenic Arabidopsis under 4 ℃ treatment

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中過表達(dá)水稻擴(kuò)展蛋白基因OsEXPA17和小麥擴(kuò)展蛋白基因TaEXPB1A,均能顯著促進(jìn)擬南芥根系網(wǎng)絡(luò)的建成,并提高生物量,進(jìn)而促進(jìn)植株生長[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長和側(cè)根數(shù)目均明顯高于野生型,說明TaEXPB12-A/B/D基因顯著促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因擬南芥根的生長,有利于植株在干旱脅迫條件下更有效地吸收土壤中的水分和養(yǎng)分。Cho等[21]研究表明,在擬南芥中過表達(dá)擴(kuò)展蛋白基因AtEXP10增加了植株的葉面積,相反,抑制其表達(dá)則導(dǎo)致葉面積減小。本研究發(fā)現(xiàn),TaEXPB12-A/B/D基因能顯著增加擬南芥的葉寬,有助于提高葉面積。葉面積作為植物光合作用的重要指標(biāo)之一,葉面積越大,經(jīng)濟(jì)效益越高[22]。因此,TaEXPB12-A/B/D可作為農(nóng)業(yè)分子育種中提高小麥產(chǎn)量的候選基因。

在低溫脅迫下,植物對氧的利用效率降低,過量的氧在細(xì)胞內(nèi)代謝生成活性氧(ROS)[23],從而啟動氧化應(yīng)激反應(yīng),包括蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化和DNA損傷,甚至造成細(xì)胞死亡[24],使植物細(xì)胞膜的完整性喪失,而較高水平的抗氧化酶活性有助于清除植物體內(nèi)的ROS,維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中過表達(dá)新疆沙冬青(Ammopiptanthusnanus)擴(kuò)展蛋白基因AnEXPA1和AnEXPA2,可增強(qiáng)擬南芥對低溫脅迫的抗性,且轉(zhuǎn)基因植株清除ROS的能力及抗氧化酶的活性也均顯著提高。本研究發(fā)現(xiàn),在4 ℃低溫脅迫下,過表達(dá)TaEXPB12-A/B/D三個(gè)基因的擬南芥植株中SOD、POD、CAT的活性均高于野生型,且MDA的含量較低。低溫脅迫下植物中某些小分子物質(zhì)(如脯氨酸、可溶性糖等)的含量增加,可維持細(xì)胞滲透壓,減少細(xì)胞損傷[26]。Zhang等[27]研究發(fā)現(xiàn),在熱、干旱、鹽、鎘等脅迫下,過表達(dá)白毛楊(Populustomentosa)擴(kuò)展蛋白基因PttEXPA8的煙草葉片細(xì)胞電解質(zhì)滲漏減少,滲透調(diào)節(jié)水平升高。本研究發(fā)現(xiàn),低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的可溶性糖、Pro的含量均高于野生型。這些結(jié)果表明,擴(kuò)展蛋白基因可提高轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力,從而提高植株在逆境脅迫下的耐受性和存活率,推測TaEXPB12-A/B/D三個(gè)基因在清除ROS和維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性方面也發(fā)揮著重要作用。TaEXPB12-A/B/D基因參與高寒地區(qū)冬小麥的低溫脅迫響應(yīng)過程,其相關(guān)分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。