李巧云,郭振峰,郝曉鵬,唐建衛(wèi),高 艷,殷貴鴻

(河南農業(yè)大學農學院/國家小麥工程技術研究中心/河南省小麥技術創(chuàng)新中心,河南鄭州 450046)

1 小麥莖基腐病的危害

小麥(Triticumaestivum)莖基腐病(crown rot)是由鐮刀菌屬(Fusariumspp.)的多種真菌復合侵染引起,從種子萌發(fā)到成熟期皆可發(fā)病[1]。在萌發(fā)期,病原菌抑制胚芽鞘伸長,降低出苗率,嚴重時可導致種子腐爛或幼苗枯萎[2];在苗期,受侵染的植株莖基部褐(黑)變并不斷向上侵染芽鞘、葉鞘和主莖,嚴重時整株死亡[3-4];拔節(jié)后,該病害可引起莖稈褐變壞死[5-6],出現(xiàn)枯白穗并導致減產[7]。另外,被莖基腐病病原菌侵染的植株及籽粒中還會殘留多種真菌毒素,如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、玉米赤酶烯酮(zearalenone,ZEN)等,這些毒素可損傷植株,同時影響其加工食品及飼料的安全性,嚴重危害人畜生命健康[8]。

小麥莖基腐病自上世紀50年代在澳大利亞被報道以來[9],在中國[10]、美國[7,11]、加拿大[12]、澳大利亞[13]、阿根廷[14]等多個國家被發(fā)現(xiàn),成為一種世界性的重要病害,對小麥生產造成嚴重威脅。如在澳大利亞,該病害造成小麥年均減產約10%,部分人工接種地區(qū)產量損失高達85%[13],直接經濟損失每年約7 900萬澳元[15];在美國西北部地區(qū)該病發(fā)生率高達76%[11],年均減產 9.5%,嚴重年份可達35.0%,每公頃直接經濟損失219美元[5,7]。陳厚德等[16]在1996年首次報道了江蘇省的小麥莖基腐病,隨后在河南[4,17]、河北[18-20]、山東[21]、陜西[22]等地陸續(xù)也有報道。近年來,小麥莖基腐病在中國不同麥區(qū)頻繁發(fā)生,尤其在黃淮麥區(qū),呈現(xiàn)出不斷蔓延和加重的趨勢[23-24],如河北省2013年很少見到由莖基腐病引起的小麥白穗,但2015年普遍發(fā)生,嚴重地塊白穗率達到20%～50%[20];山東省2016年小麥莖基腐病發(fā)病率為10%～30%[21],2020年該省發(fā)生面積突破80萬hm2,遍布15市123個縣(市)[25];河南省2013、2015和2016年小麥莖基腐病病田白穗率分別為0.4%～11%、0.1%～16.1%和 0.1%～31.5%[26],2019年該省部分田塊發(fā)病率高達78.9%[27]。

小麥對莖基腐病的抗性由多基因控制[3],病原菌宿主廣泛,在田間殘留秸稈上可生存數(shù)年、遇適宜環(huán)境可再次引發(fā)病害[28],加上其發(fā)病部位在莖基部,且全生育期均可發(fā)病,使該病害的防控比較困難。種植抗病品種是應對莖基腐病最經濟有效的措施,然而,國內外至今未發(fā)現(xiàn)對莖基腐病免疫的小麥品種,高抗和中抗品種也很少[4,29-31]。如Wildermuth等[29]鑒定了400 份小麥材料的成株期莖基腐病抗性,發(fā)現(xiàn)只有Gluyas Early、Mexico234和Reliance表現(xiàn)為中抗;張 鵬等[23]對82份小麥種質進行苗期莖基腐病抗性鑒定,發(fā)現(xiàn)紅蚰子、翻山小麥等13份材料達到中抗水平(15.8%);楊 云等[4]等對88份黃淮麥區(qū)主推小麥品種進行抗性鑒定,發(fā)現(xiàn)所有品種在苗期均表現(xiàn)為感病,而在成株期能達到中抗水平的只有中育8號、周麥27號等10份材料(11.4%),陽 霞[32]對1 306 份小麥材料進行苗期鑒定,發(fā)現(xiàn)80%的材料表現(xiàn)為高感?？梢?提高莖基腐病抗性是今后小麥遺傳育種工作的主要目標之一。

2 目前常用的小麥莖基腐病抗性鑒定方法

準確的表型鑒定是進行小麥抗病育種的基礎,目前,小麥莖基腐病的鑒定方法主要包括苗期和成株期抗性鑒定兩個方面,其中,苗期抗性鑒定的方法比較多,主要有土培苗接種法和水培苗接種法;成株期抗性鑒定分別在溫室與大田進行。對不同方法分類概述如下:

2.1 苗期莖基腐病抗性鑒定

2.1.1 苗期水培苗的接種鑒定

根據(jù)接種方式,又分為孢子液浸泡法、套菌碟法、小燒杯法、水培苗棉球繞莖法、培養(yǎng)皿直接加孢子液法、植株滴加孢子液法等多種,其中孢子液浸泡法和棉球繞莖法也用于土培苗的接種。

孢子液浸泡法由Yang等[33]于2010年建立,是將萌發(fā)2 d(胚芽鞘長約0.5 cm)的種子浸泡在孢子懸浮液中1～2 min后,置于濕紙巾中或格子紙上,14或21 d后進行調查[33-34]。套菌碟法由張向向等[18]于2014年建立,是將長有致病菌的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基用打孔器取菌碟,套在萌發(fā)種子的芽底部,然后用濕布包裹或置于培養(yǎng)皿中,5～20 d后進行調查[18,24]。小燒杯法由郭煒等[35]于2018年建立,是將菌碟放在有瓊脂水培養(yǎng)基的燒杯中央,然后將萌發(fā)種子繞菌碟插入培養(yǎng)基中,5 d后進行調查。此外,還有水培苗棉球繞莖法、培養(yǎng)皿直接加孢子液法[3]和滴加孢子液接種法[24]。水培苗棉球繞莖法是在幼苗莖基部纏繞醫(yī)用棉球,在棉球內側苗莖部接觸處接種孢子液并固定于水培盒中,10 d后調查病情[3];培養(yǎng)皿直接加孢子液法是將孢子液加在培養(yǎng)幼苗的培養(yǎng)皿中,10 d后調查病情[3]。滴加孢子液接種法是指在幼苗的胚芽和種子的夾角處滴加孢子液接種,5 d后調查病情[24]。

小燒杯法、套菌碟法最利于發(fā)病[24,34],但是操作起來比較麻煩,不適用于大群體的鑒定;滴加孢子液與水培苗棉球繞莖法發(fā)病較慢[3,24]、操作起來又比較麻煩,限制了其應用;孢子液浸泡法接種雖然致病性不如套菌碟法高,但適當延長培養(yǎng)時間,也能達到良好的致病效果[24],且其操作相對簡單,較適合于大批量材料的抗性鑒定[34],是目前使用較多的水培苗鑒定方法[24,33-34]。

苗期水培法一般根據(jù)苗褐變的程度,采用由Li等[36]基于Wildermuth等[37]的研究基礎上建立的0～5級記錄方法,記錄標準為:0級,無明顯褐變癥狀;1級,胚芽鞘或第一葉鞘上有明顯褐變癥狀;2級,第1葉鞘和冠間(below subcrown internode)部分壞死;3級,第二葉鞘和冠間部分或完全壞死,苗高降低(≤1/2);4級,第三葉鞘或葉片和冠間部分或完全壞死,苗高降低(>1/2);5級,整株死亡。Yang等[33]、程 睿等[34]研究均采用了此記錄標準。多數(shù)學者也對該記錄標準進行了調整,采用0～4級[35]、0～7級[18]或調整的0～5級法[3],也有記錄時根據(jù)根系褐變情況進行記錄[35,38]。在記錄病情的基礎上計算病情指數(shù)進行抗性評價。病情指數(shù)(DI)=∑[(級數(shù)×各級株數(shù))/(最高級數(shù)×總株數(shù))]×100,其中,DI=0時為免疫(I),DI=0～10.0時為高抗(HR),DI=10.1～20.0時為中抗(HR),DI=20.1～30.0時為中感(MS),DI>30.1時為高感(HS),這是目前使用較多的評價標準[3-4,35]。

2.1.2 苗期土培苗的接種鑒定

苗期土培苗接種方法主要有棉球(布)繞莖法、莖基部滴注法、天然培養(yǎng)基接種法、孢子液浸染法等。

棉球(布)繞莖法由Akinsanmi等[38]于2004年建立,在苗莖基部0.5～1.0 cm處用脫脂棉或棉布纏繞,將孢子懸浮液注入棉球(布)中,35 d后調查;Mitter等[15]也用該方法對致病菌毒性進行測定。莖基部滴注法由Mitter等[5]于2006年建立,在出苗后10 d,在莖基部0.5 cm處滴注10 μL孢子懸浮液,35 d 后調查,張 鵬等[23]、趙 凱等[31]、冀春雨[39]等均用該方法進行了種質資源的抗性鑒定,Li等[40]也利用此方法進行了抗病QTL的定位。天然培養(yǎng)基接種法的天然培養(yǎng)基為致病菌侵染后的小麥粒[41-42]、小米粒[4,43-44]、小麥大麥粒1:1混合后的粉碎物[37]或麥糠[45]等;接種方式可以是將病谷粒與滅菌土混合(菌土)后將種子播于其中[4,19],或按“播種-覆土-放病谷粒-覆土”的順序接種[17],或在萌發(fā)種子上方鋪一層病谷粒后覆土[32,37],或出苗后將病谷粒放在苗根部一側[42],一般在接種后22～45 d調查,以28 d或35 d較多[17,30,40-41]。孢子液浸泡法由Li等[36]于2008年建立,接種方法同水培苗,在抗莖基腐病QTL定位研究中應用較多[46-47],一般在接種后35 d或 45 d調查[36,46]。

苗期土培苗的不同接種方法中,天然培養(yǎng)基接種法莖基腐發(fā)病明顯,能很好區(qū)分品種抗性[37],且操作簡單、重復性好(病情指數(shù)在重復間相關性高),可大批量鑒定材料[32,44,46],是苗期抗性鑒定的首選方法。不過,其鑒定結果與成株期鑒定有一定的差異,而且需要的時間長[4];另外,該方法與品種間存在顯著的互作效應,可能導致抗病品種出現(xiàn)比感病品種更嚴重的癥狀[44,48]。棉球接種法也具有結果穩(wěn)定、品種間差異明顯的特點,但操作麻煩,且鑒定周期也比較長[3]。孢子液浸泡法的發(fā)病程度高于莖基部滴注法、能區(qū)分抗、感品種,且發(fā)病等級與田間鑒定結果一致,穩(wěn)定可靠、重復性好,可實現(xiàn)高通量、大規(guī)模的鑒定[49],不過該方法可能導致較高的死苗率[34,36,44]。莖基部滴注法也能較好的鑒定品種抗性、鑒定結果與成株期抗性結果較為一致[5,39,44],但是比較繁瑣、試驗誤差較大(變異系數(shù)50%～78%)[43]。通過以上分析可知,不同接種方法均能區(qū)分抗、感品系,但從便于操作、高通量的角度考慮,天然培養(yǎng)基接種法和孢子液浸泡法相對較好,目前應用最廣泛的是病小米粒/小麥粒天然培養(yǎng)基接種法[32,42,46]。

苗期土培苗鑒定結果記錄方法較多,常用的有3種:莖基腐癥狀分級(crown rot score)[7,19,31,46 ]、嚴重度指數(shù)(crown rot severity index)[5,39]和葉鞘癥狀得分和(leaf sheath sum)[37],其中以莖基腐癥狀分級法使用最廣泛、葉鞘癥狀得分和使用較少,嚴重度指數(shù)主要用于莖基部滴注法[39,44]。莖基腐癥狀分級的方法較多,其中由Li等[36]建立的0～5級法(同2.1.1水培苗接種鑒定記錄方法)最常用。一些學者對0～5級標準稍有修改[23,29-31],另外還有0～6級法[42]、0～7級法[7]、0～8級法[30,41]、0～9級法[4,19,32]以及0～10級法[46,49]等。在記錄莖基腐癥狀基礎上計算病情指數(shù),病情指數(shù)計算及抗性評價標準同2.1.1。嚴重度指數(shù)(I) =(主莖褐變長度/苗長)×褐變葉鞘的層數(shù),該值一般在0～3之間[5,39,43]。然后依據(jù)嚴重度指數(shù)進行抗性評價,即免疫(I=0)、高抗(I≤0.050)、抗(I = 0.051～0.100)、中抗(I=0.101～0.150)、中感(I= 0.151～0.200)、感(I=0.201～0.250)、高感(I= 0.250)[39]。葉鞘癥狀得分和是按照0～4級標準對第1～3片葉鞘進行調查,然后將3片葉的得分相加(最高總分為12分),其標準為:0級,葉鞘完全健康;1級,葉鞘褐變<25%;2級,葉鞘褐變?yōu)?5%～50%;3級,葉鞘褐變?yōu)?1%～75%;4級,葉鞘褐變>75%[37]。

2.2 成株期莖基腐病抗性鑒定

2.2.1 成株期溫室鑒定

進行成株期溫室鑒定的研究不多,一般采用天然培養(yǎng)基接種法,將種子播于盆中,覆蓋約2 cm的土,然后將病谷粒撒在種子上方再覆土[7]或者在拔節(jié)時將病麥粒放在小麥莖基部[42],于灌漿期調查。

成株期溫室鑒定結果采用0～7級法記載,具體為:0級,無癥狀;1級,盾片節(jié)(scutellar node)褐變;2級,盾片節(jié)、冠節(jié)或葉鞘褐變;3級,盾片節(jié)、冠節(jié)或葉鞘褐變嚴重、植株不死;4級,節(jié)間、葉鞘和下部莖稈褐變、植株有死亡癥狀;5級,莖稈腐爛、植株瀕臨死亡;6級,莖稈腐爛、植株(有3片以上葉子)死亡;7級,因種子腐爛或幼苗腐爛而致植物死亡[7]。也有0～4級法記載,具體為:0級,無癥狀;1級,地上第一莖節(jié)出現(xiàn)褐變,但沒到第二莖節(jié);2級,第一莖節(jié)完全褐變,并擴展到第二莖節(jié);3級,褐變擴展到第三莖節(jié)及以上,部分出現(xiàn)白穗現(xiàn)象,植株接近死亡或已經死亡;4級,植株不抽穗,黃化死亡[4,42]。

2.2.2 成株期大田鑒定

成株期大田鑒定一般也采用天然培養(yǎng)基接種法,Wallwork等[45]建立了Terrace method,即將塑料管 (10 cm×5 cm)填土至1/2處,放好種子并蓋土至3/4處,剩下1/4填滿病麥糠與土的混合物,將塑料管放在鋼板箱中埋到大田中,該方法避免了田間雜菌污染、接種不均勻等問題,但是無法區(qū)分有部分抗性的硬粒小麥。也有不少學者采用人工開溝、將病谷?；蚱浞鬯槲锞鶆蛉龅綔侠镌俨シN[7,37],或先將病米粒與表層土混勻再開溝播種[4],或以發(fā)病嚴重地塊為自然病圃進行鑒定[30]。由于受接種量差異、雜菌侵染、氣候以及環(huán)境條件等因素的不同,大田鑒定結果的重復性較差[4,45,48]。

成株期抗性鑒定一般分兩次調查,第一次在出苗21～35 d時,調查一定面積的出苗數(shù)和死苗(明顯黃化或干枯死亡)數(shù)、以及莖基腐癥狀分級(記載方法基本同苗期標準)[7,17];成熟期時記載病蘗數(shù)和白穗數(shù),計算病蘗率指數(shù)(品種病蘗率/高感對照品種的病蘗率)和白穗率[4,37]、以及小區(qū)產量[5,7,28],另外還按照0～4級標準記載主莖癥狀[4,17,42],病情指數(shù)計算與抗性評價標準同苗期?？梢?成株期的記錄既考慮了莖稈褐變的嚴重程度,也考慮了白穗率和產量變化。

2.3 苗期與成株期抗性鑒定方法比較

2.3.1 苗期抗性鑒定的優(yōu)勢與不足

相對于成株期鑒定來說,苗期鑒定具有明顯的優(yōu)勢,具體表現(xiàn)如下:(一)結果穩(wěn)定:與大田環(huán)境相比,溫室中的溫度、濕度、光照等條件易控制,多次鑒定結果的相關性較高、重現(xiàn)性好[37,45]。(二)節(jié)省空間:苗期鑒定尤其是水培苗的接種鑒定在培養(yǎng)皿或濕紙巾中進行,無需用培養(yǎng)基質,占用空間少。(三)節(jié)省時間:天然培養(yǎng)基接種試驗周期一般30～45 d,濕紙巾法7～14 d,而菌碟接種法在最優(yōu)條件下僅為5 d。(四)可隨時進行:苗期鑒定不受小麥生育期限制,可以隨時進行,一年內可以進行多次鑒定?；谶@些優(yōu)勢,目前小麥莖基腐病抗性鑒定大都采用苗期溫室鑒定方法。

但是苗期鑒定也有明顯的不足,與大田鑒定結果相比,苗期鑒定結果發(fā)病情況更加嚴重。原因可能是溫室的溫度、濕度等條件均適宜病菌侵染與病害發(fā)展,加上溫室的幼苗生長快、長勢較弱,導致植株易感病且發(fā)病較重,只有抗病性好的種質才能被鑒定出來,而抗病性較弱的種質不能被鑒定到,這就容易忽視育種中有價值的中抗或中感種質[45],其鑒定結果也與田間自然條件下發(fā)病情況存在一定的差異[41]。

2.3.2 成株期抗性鑒定的必要性與不利條件

盡管苗期鑒定應用廣泛,田間的多年鑒定也是必要的[41]。主要原因是莖基腐病病原菌的侵染并不局限于某個特殊的時期、在整個生育期內均可發(fā)生[6]。苗期受侵染在成株期的表型與成株期才受到侵染的表型是否一致尚不明確[41],所以成株期鑒定是非常必要的。然而成株期鑒定尤其是大田鑒定往往受諸多不利因素的限制。(1) 重復性差:諸多環(huán)境條件如土壤類型、栽培措施、氣象因子等都會影響發(fā)病程度[37,45],還有其他致病菌如小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、全蝕病菌(Gauemannomycesgraminis)、紋枯病菌(Rhizoctoniacerealia)等的污染與互作也影響莖基腐病的發(fā)生發(fā)展,特別是氣象因子在不同年點間存在較大差異,所以,基于大田的鑒定結果往往不穩(wěn)定[5],因此基于大田表型的抗莖基腐病QTL定位結果報道較少。(2) 周期長:莖基腐病成株期抗性鑒定一年只能進行一次,而且需要較大的面積[4,17],對大量材料的鑒定存在一定的困難。(3) 發(fā)病程度不充分:大田環(huán)境特別是氣象條件如果不適宜病原菌定殖和繁衍,在很大程度上影響病情發(fā)生發(fā)展[51],因此與室內苗期抗性鑒定結果相比,田間成株期發(fā)病程度普遍較輕。

2.3.3 苗期抗性評價成株期抗性的可行性與局限性分析

小麥莖基腐病苗期抗性與成株期抗性具有較高的相關性[13,38]。如Wildermuth等[37]和Mitter等[5]分別對28個和16個澳大利亞小麥品種進行苗期、成株期抗性鑒定,結果顯示,苗期抗性與大田抗性鑒定結果呈高度正相關(r=0.78～0.98);冀春雨[39]對中國58個冬小麥品種進行鑒定,發(fā)現(xiàn)大田與溫室的抗性結果基本一致。由于苗期室內鑒定條件易控制、發(fā)病一般較重,室內鑒定的部分抗病品種在大田中表現(xiàn)出良好抗性[15,36]。這些結果為利用苗期抗性評價成株期抗性奠定了基礎,這可能也是目前莖基腐病抗性鑒定普遍采用苗期鑒定的主要原因。

也有不少研究結果表明,苗期抗性與成株期抗性相關性不高,一些苗期抗性良好的品種在成株期抗性較差[5],而一些苗期感病的種質在成株期表現(xiàn)為抗病[4],如蘇麥3號在苗期對莖基腐病病原菌表現(xiàn)為高感,而在成株期表現(xiàn)為抗病[42]。另外,在不同的年份或不同試驗方法鑒定中,同一品種對莖基腐病的抗性也會有明顯差異[52-53]。Yang等[33]研究發(fā)現(xiàn),源于Lang/CSCR6的RIL群體的苗期抗性與大田成株期抗性的相關性只有0.44,基于大田鑒定檢測到2個QTL,只有4B染色體上效應小的QTL在苗期鑒定數(shù)據(jù)中能檢測到,而3B染色體上效應大的QTL卻沒有檢測到,這與Poole等[46]研究中“苗期與成株期的抗莖基腐病QTL不一致”的結論相符?？梢?以苗期抗性鑒定結果預測成株期抗性有一定的局限性,這可能是苗期和成株期抗莖基腐病的遺傳位點不完全相同[42]。作物對病害的苗期抗性和成株期抗性存在差異,這在小麥條銹病等病害中也有類似報道[54]。

可見,雖然苗期鑒定是當前莖基腐病抗性鑒定的主要方法,但是為了更客觀評價小麥品種的莖基腐病抗性,經苗期抗性鑒定篩選出的抗病材料仍需要進一步進行多年多點的成株期抗性接種鑒定。

3 目前鑒定方法存在的主要問題

目前小麥莖基腐病抗性鑒定方法多樣,但是操作簡便、結果穩(wěn)定、快速、高通量的方法缺乏,一定程度上制約了小麥抗莖基腐病育種的效率。

3.1 缺乏統(tǒng)一的標準

小麥莖基腐病抗性鑒定工作雖然一直在持續(xù)進行,但是國內外的研究大多不夠深入,缺乏統(tǒng)一標準的鑒定方法[5],不同研究者采用不同的方法、對同一個種質的鑒定結果不一致。如陸寧海等[41]于2015年采用天然培養(yǎng)基(小麥)接種和病情指數(shù)法評價44個小麥品種的苗期抗性,發(fā)現(xiàn)百農207在苗期中抗莖基腐病;于2016年以同樣的接種方法和病情指數(shù)法評價19個小麥品種的抗性,發(fā)現(xiàn)百農207在苗期中感莖基腐病[30]。而冀春雨[39]采用莖基部滴注法進行鑒定,發(fā)現(xiàn)百農207在苗期高感莖基腐病。因此,由于缺乏統(tǒng)一的鑒定方法和評價標準,導致不同學者的抗病鑒定結果不同,給小麥莖基腐病研究及育種工作者帶來一定的困難。

3.2 不利于高通量檢測

多數(shù)現(xiàn)有的小麥莖基腐病抗性鑒定方法由于缺乏重復性和不適合高通量篩選,而不能有效評估育種中大量新品系的抗性[37,45,48]。如Mitter等[5]提出的莖基部滴注法,需要在相同的位置接種每株幼苗,接種后還要留出足夠的空間容納植株;小燒杯法、套菌碟法有利于快速發(fā)病[29,41],但是由于每株幼苗都要套菌碟或插入培養(yǎng)基中、操作起來比較麻煩、耗時長,主要用于致病菌毒性測定;天然培養(yǎng)基接種法應用居多,但是需要土培盆栽,占用較大的空間且鑒定所用的時間較長,不同研究者所用土壤介質也較難統(tǒng)一,導致試驗結果會存在一定的誤差[4,44,48]。

4 關于小麥莖基腐抗性鑒定的建議

針對目前莖基腐病抗性鑒定方法多樣、不同學者鑒定結果無法相互比較、同一種質因鑒定方法不同而結果不一致的現(xiàn)象,提出2點建議,以期為準確鑒定小麥莖腐病抗性提供有用信息。

4.1 加強苗期抗性鑒定的標準化

苗期鑒定快速高效、重復性強,又能在一定程度上反映成株期抗性,可以從接種方式、植株培養(yǎng)條件、記載評價等方面建立國際認可的標準鑒定方法,從而使不同的鑒定結果能夠相互比較。

接種方法:現(xiàn)有的苗期接種鑒定方法一般都可以區(qū)分抗、感品系,從高通量的角度考慮,孢子液浸泡法和天然培養(yǎng)基接種法比較可行。鑒定過程中,幼苗何時處理、孢子液濃度、使用前是否添加吐溫(Tween)[36]或甲基纖維素(Methyl cellulose)[44]等輔助劑以及浸泡時間等關鍵環(huán)節(jié)要有明確的標準。經過不少學者的努力,已初步建立了孢子液浸泡的接種程序:催芽2～3 d的萌發(fā)種子,在濃度為1×105～5×106個·mL-1的孢子液中(加吐溫20,0.1% v/v)浸泡1～2 min,然后移栽,黑暗保濕24或48 h[33-34,50],如果是大田播種,則在播種前 2 d用吐溫20浸泡處理,晾干后播種[46]。天然培養(yǎng)基接種法的培養(yǎng)基以病小米粒[4,32]或小麥粒[41-42]較多,病谷粒于播種時放在種子上方[4,37,46]或一葉一心至三葉期時放在苗基部[41-42]進行接種,這些研究為建立標準的接種方法奠定了良好基礎。

植株培養(yǎng)條件:植物培養(yǎng)條件是影響病害發(fā)展的重要因素。培養(yǎng)溫度、濕度以及光照時間等因素都需要標準化。國內外學者對此也進行了不少研究。如研究發(fā)現(xiàn),最適培養(yǎng)溫度為24～27 ℃時[24,27],適度的缺水會加劇植物莖基腐病的發(fā)生,增加植株死亡率[54]。一般在接種前期保持濕潤、而后期出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象時才澆水,可促進莖基腐病的發(fā)展[34,36]。Mitter等[5]優(yōu)化了接種后適宜莖基腐病發(fā)展的培養(yǎng)條件,即白天(光照)12 h,25 ℃,相對濕度60%;晚上(黑暗)12 h,15 ℃,相對濕度80%。多名學者均采用了這一培養(yǎng)程序[23,31,44,46]。

評價標準:目前,葉鞘發(fā)病級別[5,31,37,45]、病蘗率[4,29,37,48]、白穗率[4,7,30,42]、產量損失率[7,48]等都可以作為評價莖基腐病抗性的依據(jù),尚無統(tǒng)一標準。因為苗期接種后癥狀主要表現(xiàn)在第1～3葉鞘,不同葉鞘發(fā)病程度也有差異[5,31,39,45],所以,苗期抗性主要依據(jù)葉鞘發(fā)病等級計算的病情指數(shù)進行評價。葉鞘發(fā)病級別的三種記載方法(莖基腐癥狀分級、嚴重度指數(shù)、葉鞘癥狀得分和)都能顯著的區(qū)分抗、感品種(P值在0.000 3～0.026 5之間),且鑒定結果高度相關(相關系數(shù)在0.86～ 0.92之間)[43,46],其中,以莖基腐癥狀分級的記錄方法最節(jié)約時間,其所用時間是嚴重度指數(shù)的50%,葉鞘癥狀得分和的70%[46]。苗期鑒定標準方法的建立要充分考慮接種均勻性、培養(yǎng)條件、記載時間與標準的一致性,以增強鑒定結果的穩(wěn)定性與可靠性。

4.2 加強成株期抗性鑒定的研究

受氣象因素等諸多因素的限制,小麥莖基腐病成株期抗性鑒定方法的研究很少,急需建立標準的鑒定方法。

在莖基腐病發(fā)生嚴重的地塊,進行自然病圃鑒定[43]是可行的辦法,但由于莖基腐病受氣象因子的影響較大,導致鑒定結果在年度間存在較大差異。另外,由于致病菌分布不均勻或不充分,導致發(fā)病率低或者部分植株“避病”,這對檢測純系品種抗性時所受影響較小,然而在育種或基因定位中往往需要對分離群體進行鑒定、尤其是F2群體抗性鑒定時,每個單株的鑒定結果可能不一樣,而“避病”現(xiàn)象對鑒定結果的影響很大[48]。所以,應對接種時期、接種方式及保濕方法等重要因素進行探究,建立標準鑒定方法。

接種時期:Moyano等[55]研究認為,小麥最易感莖基腐病的時期是抽穗期和揚花后期,提前接種會導致灌漿和揚花期延長,使病害加重。Dodman等[48]對出苗期、拔節(jié)期、抽穗期、乳熟期接種的結果也表明,接種時間越早、病情越嚴重。目前采用病谷粒法接種的大田抗病性鑒定一般在播種時將病谷粒灑在種子上方或與土混勻后播種[4,45-46],但播種時接種會導致嚴重的幼苗枯死現(xiàn)象[6,48],因此應開展不同生育期進行接種鑒定的研究,以明確接種的關鍵期。

接種方法:Dodman等[48]認為播種時將病谷粒施入土壤中是一種合適的方法,可以提高病害水平,這也是目前常用的大田鑒定接種方法[4,45-46]?；诖?Dodman等[48]建立了大田接種鑒定的標準方法,即種植時將病谷粒粉(病大麥與小麥粒晾干磨碎過篩后1∶1混合)施入土壤中中,1行1 m的施用量為3.0 g)。

記錄方法及評價標準:成株期的評價指標較多,主要有病蘗率、莖稈癥狀嚴重程度、白穗率、產量損失率[4,30,37,48]等。白穗率是評價莖基腐病抗性的快速方法,然而,白穗發(fā)育也受環(huán)境因素影響,多種病害如根腐病、赤霉病、紋枯病都能引起白穗,故不適宜作為常規(guī)指標用于莖基腐病的抗性鑒定[48]。產量是小麥生產者最感興趣的部分,莖基腐病對產量有顯著影響[6],然而產量的影響因素很多,也不適宜作為莖基腐病成株期抗性的唯一指標。有研究者發(fā)現(xiàn),產量損失與病蘗率之間存在顯著的相關性[48],因此,病蘗率可以作為評價莖基腐病抗性的可靠指標。從目前的研究結果看,病蘗率結合莖稈癥狀嚴重程度可以作為成株期抗性評價的指標,如果想了解品種對莖基腐病的耐受性,則要結合產量、白穗率等進行綜合判定。

總之,對于大量材料,可以先進行苗期鑒定、然后對初篩過的材料再進行大田成株期抗性鑒定,以減少工作量。另外,小麥莖基腐病和赤霉病都是由鐮刀菌屬真菌引起的病害,抗赤霉病有抗侵入(Type I)、抗擴展(Type II)、抗毒素積累(Type III)、低病粒率(Type IV)、寄主耐病性(Type V)等五種抗病類型[56],莖基腐病抗性可能也有不同類型,如在Dodman等[48]將孢子液接種在莖表面時,抗病品種(Gala)的癥狀顯著低于感病品種(Gamut)(抗侵入);但是當將孢子液注射進莖中時,抗感品種間差異不顯著(抗擴展)。不同抗性鑒定方法各具特色,天然培養(yǎng)基接種法比較適合大量育種材料或遺傳群體的鑒定[32,39];莖基部滴注法有助于研究莖組織上病害的生物學和發(fā)展過程[46];小燒杯法、套菌碟法和棉球接種法則適用于病原菌的致病力檢測[3,24,35]。根據(jù)不同的研究目的,建立快速、高效、簡便、重復性高的標準鑒定方法,是進行小麥莖基腐病抗性鑒定、抗性位點檢測及抗病機制研究的基礎。