李 爽,謝丹露,吳繼周,馬 瑞,謝艾迪,邵 蕾,高娟娟,韓海霞

(新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】紅棗(Ziziphusjujubadates)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬植物棗樹(ZiziphusjujubaMill.)的果實[1],是藥食兩用原料之一[2]。紅棗中主要有多糖[3]、黃酮類[4]、多酚類[5]、五環(huán)三萜類[6]等功能成分,具有多方面的藥理作用[7]、抗氧化[8,9]等作用,逐漸成為加工利用和天然健康食品研究的熱點[10]。比較不同炮制方法對紅棗功能成分及抗氧化活性的影響,對紅棗的加工利用有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】紅棗歷代就有許多炮制方法,主要為制膏、蒸制、煮制、酒炙、炒制等,而到目前為止仍然使用的有蒸制、煮制、炒制等幾種炮制方法[11]。王克周[12]對紅棗的炮制方法進行了研究,認為紅棗通過不同方法的炮制后,紅棗的水溶性成分最大限度地進入煎液,提高了紅棗的利用率。【本研究切入點】炮制是指對中草藥進行烘、炒、泡、蒸、煮等方法的加工,不僅能使藥材潔凈、矯味、干燥,而且還降低了藥材的毒性,使其不易變質(zhì)[13]。炮制還可以使藥材的療效增強,藥材的性能發(fā)生改變,便于調(diào)劑制劑的作用[14]。紅棗使用不同的炮制方法,可能使其在配方中發(fā)揮不同的功效[15]。目前,紅棗經(jīng)蒸、煮、炒等不同炮制方法后,其中主要活性物質(zhì)含量和抗氧化活性是否不同,尚未明確。需研究不同炮制方法下若羌灰棗主要功能成分及抗氧化活性的對比?！緮M解決的關鍵問題】以新疆紅棗品種若羌灰棗為原料,采用蒸制、煮制和炒制等方法對若羌灰棗進行炮制,分析比較與灰棗生品相比,研究不同炮制方法下若羌灰棗的主要活性成分含量及抗氧化能力的不同,為采用最適宜的灰棗使用方法提供更準確的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

紅棗品種選用若羌灰棗,購于新疆巴州若羌縣。

1.1.2 試劑

1,1二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(純度>97%),2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺(ABTS)(純度>98%)均購自于上海麥克林生化有限公司,批號:20200825;蘆丁標準品(批號:153-18-4),沒食子酸標準品(批號:149-91-7),福林酚(批號:NONE6060) 均購自于上海麥克林生化科技有限公司;無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、VC、均為分析純,購自于天津市致遠化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器

80-1電動離心機(金壇市恒豐儀器廠),KQ2200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),ZWY-200D型智城恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司),T-6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 方法

1.2.1 若羌灰棗樣品前處理

1.2.1.1 灰棗生品

選同一批若羌灰棗洗凈,切片,85℃干燥8 h,至恒重。

1.2.1.2 蒸制品

取潔凈的若羌灰棗適量,至鍋內(nèi)隔水蒸制0.5 h,切片,85℃干燥8 h,至恒重。

1.2.1.3 煮制品

取潔凈的若羌灰棗適量,置鍋內(nèi)待水開后煮0.5 h,切片,85℃干燥8 h,至恒重。

1.2.1.4 炒制品

取潔凈的若羌灰棗適量,置鍋內(nèi)炒至其外表皮破裂,表灰棗面出現(xiàn)焦斑,切片,85℃干燥8 h,至恒重。

1.2.2 樣品溶液的制備

準確稱取1 g不同炮制方法的若羌灰棗于燒杯中,向燒杯內(nèi)加入75%乙醇30mL,稱重后封口,并浸泡1 h,隨后60℃超聲提取40 min,再稱定重量,加75%乙醇補足減失的重量,過濾,取濾液于4 000 r/min離心15 min,得到不同炮制方法若羌灰棗供試品溶液。

1.2.3 不同炮制方法下若羌灰棗總黃酮含量

1.2.3.1 蘆丁對照品溶液制備

精密稱取0.020 0 g的蘆丁對照品于容量瓶中,用75%乙醇定容至100 mL,即為0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液,備用。

1.2.3.2 蘆丁標準曲線繪制

參照李連芳等[13]方法繪制蘆丁標準曲線。

1.2.3.3 供試品溶液的測定

分別取不同炮制方法若羌灰棗供試品溶液各2 mL,平行3份,顯色反應同“1.2.3.2”方法操作,將510 nm處所測吸光度值帶入回歸方程,并計算含量。

1.2.4 不同炮制方法下若羌灰棗總多酚含量

1.2.4.1 沒食子酸對照品溶液制備

精密稱取0.010 0 g的沒食子酸于容量瓶中,用蒸餾水定容至100 mL,即為0.1 mg/mL的沒食子酸對照品溶液,備用。

1.2.4.2 沒食子酸標準曲線繪制

參照陳葉等[16]方法繪制沒食子酸標準曲線。

1.2.4.3 供試品溶液測定

分別不同炮制方法若羌灰棗供試品溶液各0.3 mL,平行3份,顯色反應同“1.2.4.2”方法操作,于765 nm處所測吸光度值帶入回歸方程,并計算含量。

1.2.5 不同炮制方法下若羌灰棗總三萜含量

1.2.5.1 齊墩果酸對照品制備

精密稱取0.005 0 g的齊墩果酸對照品,用甲醇溶解,并定容至25 mL的容量瓶中,搖勻,即得齊墩果酸對照品溶液。

1.2.5.2 齊墩果酸標準曲線繪制

參照張娜等[17]方法繪制齊墩果酸標準曲線。

1.2.5.3 供試品溶液測定

取不同炮制方法灰棗提取液0.1 mL于10 mL容量瓶中,顯色反應同“1.2.6.2”方法操作,于560 nm處所測吸光度值帶入回歸方程,并計算含量。

1.2.6 不同蒸制時間下若羌灰棗體外抗氧化

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力

參照潘俊等[18]方法稍作改進,精密稱取DPPH 0.005 0 g,加入無水乙醇溶解,超聲使其充分溶解,定容至棕色容量瓶中,得到0.05 mg/mL DPPH儲備液,現(xiàn)配現(xiàn)用,避光使用。分別加入2 mL不同濃度的若羌灰棗供試品溶液和2 mL的0.05 mg/mL DPPH乙醇溶液于試管中,混勻并避光,進行30 min反應后,在517 nm的波長處測定其吸光度為A1;分別加入2 mL不同濃度的若羌灰棗供試品溶液與無水乙醇2 mL于試管中,搖勻,反應后測定其吸光度為A2,分別加入2 mL的DPPH乙醇溶液和2 mL 75%乙醇溶液于試管中,混勻反應后測得其吸光度為A0。VC為陽性對照,利用“公式(1)”計算樣品的DPPH自由基清除率。

(1)

式中,A1:若羌灰棗供試品溶液+DPPH乙醇溶液,A2:若羌灰棗供試品溶液+無水乙醇,A0:DPPH+75%乙醇溶液。

1.2.6.2 ABTS自由基清除能力測定

參照劉洪巖等[19]方法,用蒸餾水將2,2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)配制成濃度為7.4 mmol/L的溶液,取上述溶液6 mL加入6 mL過硫酸鉀水溶液(2.6 mmol/L),混合均勻,避光反應12～16 h,即為ABTS溶液。將ABTS溶液用無水乙醇稀釋至吸光度在(0.70±0.02),為A0。取3.2 mL稀釋液于試管中,加入0.8 mL若羌灰棗供試品溶液混勻,避光靜止6 min,于734nm處測定其吸光度。VC為陽性對照,利用“公式(2)”計算ABTS自由基清除率。

(2)

式中,A0為ABTS溶液的吸光度,A為加樣品后的吸光度。

1.2.6.3 還原力測定

參照Lee等[20]方法,取0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH = 6.6) 1 mL和1mL質(zhì)量分數(shù)為1%鐵氰化鉀于試管中,再加入1 mL不同濃度的若羌灰棗供試品溶液,用漩渦混合器混勻,在50℃水浴鍋中反應20 min,隨即用流水沖至冷卻。冷卻后再加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸,混勻。取上清液2 mL,加入2 mL蒸餾水,加入0.4 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的三氯化鐵,搖勻,于700 nm處測定吸光度,蒸餾水為空白對照,VC為陽性對照,其吸光度越大,其還原能力越強。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測定含量測定及體外抗氧化指標時,每個指標均至少重復測定3次,實驗數(shù)據(jù)用Origin-2017、SPSS-19.0 計算并分析。

2 結果與分析

2.1 不同炮制方法下若羌灰棗總黃酮含量比較

研究表明,若羌灰棗生品與蒸制品、煮制品相比,總黃酮含量存在著顯著性差異(P<0.05),若羌灰棗經(jīng)炮制后總黃酮含量發(fā)生變化?；覘椛分锌傸S酮含量為(2.15±0.09) mg/g,灰棗經(jīng)炮制后,蒸制品中總黃酮含量達到最高,為(2.56±0.07) mg/g,其次為炒制品(2.02±0.04) mg/g,煮制品中總黃酮含量最低,為(1.7±0.08) mg/g。圖1

圖1 不同炮制方法下若羌灰棗總黃酮含量變化

2.2 不同炮制方法下若羌灰棗總多酚含量比較

研究表明,不同炮制方法下若羌灰棗與灰棗生品相比總多酚含量存在顯著性差異(P<0.05),若羌灰棗經(jīng)炮制后總多酚含量均低于生品?；覘椛分锌偠喾雍繛?66.73±1.22) mg/g,灰棗經(jīng)炮制后,煮制品中總多酚含量最高,為(52.98±0.58) mg/g,其次為炒制品(47.62±0.35) mg/g,蒸制品中總多酚含量最低,為(46±0.97) mg/g。圖2

2.3 不同炮制方法下若羌灰棗總三萜含量比較

研究表明,不同炮制方法下若羌灰棗總三萜含量存在顯著性差異(P<0.05)?；覘椛分锌側坪繛?35.86±0.49) mg/g,經(jīng)炮制后,蒸制品中總三萜含量最高,為(46.56±1.62) mg/g,煮制品中總三萜含量為(27.01±0.71) mg/g,炒制品中總三萜含量為(22.35±0.43) mg/g。圖3

圖2 不同炮制方法下若羌灰棗總多酚含量變化

2.4 不同炮制方法下若羌灰棗抗氧化比較

2.4.1 對DPPH自由基的清除能力

研究表明,在0.1～25.6 mg/mL濃度范圍內(nèi),不同炮制方法灰棗對DPPH自由基的清除率隨濃度的增大而增大,在0.1～1.6 mg/mL,不同炮制方法若羌灰棗對DPPH自由基的清除率呈線性增加;在1.6～25.6 mg/mL,灰棗對DPPH自由基清除率隨濃度的增加而緩慢增加。在0.1～25.6 mg/mL,灰棗生品對DPPH自由基清除率的IC50為2.03 mg/mL,蒸制品IC50為1.36 mg/mL,煮制品IC50為4.97 mg/mL,炒制品IC50為2.42 mg/mL,同濃度范圍VC的IC50為0.04 mg/mL。不同炮制方法灰棗對DPPH自由基有著良好的清除能力,其中蒸制品對DPPH自由基清除能力最好,但與VC對DPPH自由基清除能力相比,不同炮制方法灰棗對DPPH自由基清除能力始終低于VC。圖4

圖4 不同炮制方法下灰棗對DPPH自由基的清除能力變化

2.4.2 不同炮制方法對ABTS自由基的清除能力變化

研究表明,當濃度在0.125～1 mg/mL,隨著濃度的不斷增加,不同炮制方法灰棗對ABTS自由基的清除能力也隨之增大,當濃度在0.125～0.5 mg/mL時,不同炮制方法灰棗對ABTS自由基的清除速率呈線性增加;當濃度為1 mg/mL時,蒸制品對ABTS自由基的清除率最高,達到78.68%,其次為灰棗生品(73.36%),炒制品為66.14%,煮制品清除率最低,為65.29%;而當濃度大于1 mg/mL時,對ABTS自由基清除率隨濃度增加幾乎不再增加;在0.125～2 mg/mL,灰棗生品對ABTS自由基清除率的IC50為0.21 mg/mL,蒸制品IC50為0.27 mg/mL,煮制品IC50為0.52 mg/mL,炒制品IC50為0.38 mg/mL,同濃度范圍VC的IC50為0.09 mg/mL。不同炮制方法灰棗對ABTS自由基有著良好的清除能力,其中灰棗生品和蒸制品對ABTS自由基清除能力最好,但與VC對ABTS自由基清除能力相比,不同炮制方法灰棗對ABTS自由基清除能力始終低于VC。圖5

2.4.3 不同炮制方法對灰棗還原能力的影響

研究表明,隨著灰棗濃度不斷的增加,反應體系的吸光度也不斷增大。在0.125～2 mg/mL濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加,不同炮制方法下灰棗的還原能力也增大,表現(xiàn)出良好的量-效關系,但與VC的還原能力相比,灰棗及其炮制品還原能力始終低于VC,其中蒸制品總還原能力最高。圖6

圖5 不同炮制方法下灰棗對ABTS自由基的清除能力變化

3 討 論

試驗中若羌灰棗蒸制品中總黃酮含量高于灰棗生品,可能是因為蒸制過程中隨著溫度的升高,使得一些黃酮苷發(fā)生水解,產(chǎn)生更多的黃酮所致[21],白浩東等[22]研究發(fā)現(xiàn)知母經(jīng)炮制后黃酮類化合物及總糖含量均升高。而煮制灰棗中總黃酮含量降低,是因為煮制過程中總黃酮類化合物溶于水中而流失。試驗中煮制灰棗中總黃酮含量與灰棗生品相比,總黃酮含量由生品中(2.15±0.09) mg/g降至(1.7±0.08) mg/g,損失率達20.93%。試驗中若羌灰棗經(jīng)炮制后總多酚含量下降,可能是因為高溫使不穩(wěn)定的酚類物質(zhì)發(fā)生降解,產(chǎn)生不同程度的降低。試驗中若羌灰棗蒸制品中總三萜含量顯著升高,可能是因為蒸制過程中蒸汽中水分進入灰棗內(nèi)部,使總三萜有效溶出,增加了含量;煮制灰棗中總三萜含量與灰棗生品相比,總三萜含量由生品中(35.86±0.49) mg/g降至(27.01±0.71) mg/g,損失率達24.68%,與張娜等[17]的研究結果相似,干棗經(jīng)蒸制后總三萜類化合物含量顯著增加。

DPPH法是利用其乙醇溶液在517 nm波長處具有特征吸收峰,當加入抗氧化劑后,若出現(xiàn)吸光度值下降,則表示該抗氧化劑對自由基具有清除能力,因測量的簡單性,迅速性和靈敏性而被廣泛用于檢測物質(zhì)的抗氧化能力[23]。劉君等[24]研究表明黑芝麻經(jīng)炮制后體外抗氧化能力增強,其中生品、蒸制品和炒制品的IC50分別為1.058、0.225、0.632 mg/mL。試驗中生品、蒸制品、煮制品和炒制品對DPPH自由基清除能力的IC50分別為2.03、1.36、4.97、2.42 mg/mL,蒸制品對DPPH自由基清除能力最高。經(jīng)抗氧化成分氧化后,ABTS可以生成穩(wěn)定的陽離子自由基,使反應體系顏色減弱[25]。李香等[26]研究發(fā)現(xiàn)三顆針經(jīng)炮制后其體外抗氧化能力增強。吳豐鵬等[27]研究發(fā)現(xiàn)黃精生品對ABTS自由基清除能力的IC50為8.71 mg/mL,黃精蒸制品對ABTS自由基清除能力的IC50為7.53 mg/mL。試驗中生品、蒸制品、煮制品和炒制品對ABTS自由基清除能力的IC50分別為0.21、0.27、0.52、0.38 mg/mL,灰棗生品和蒸制品對ABTS自由基清除能力最高。還原力是指在反應過程中,氧化劑可以將鐵氰化鉀的三價鐵還原成二價鐵,進一步使反應體系的吸光度值增大,可以用A700來表示其還原力的強弱,吸光值越大,還原力將越強。試驗中灰棗蒸制品的還原力最強,煮制品的還原力最弱。經(jīng)不同方法炮制后灰棗其他藥理作用是否也發(fā)生變化值得進一步研究。

4 結 論

若羌灰棗生品經(jīng)蒸、煮、炒法炮制后,其中總黃酮、總多酚和總三萜含量都會發(fā)生不同程度的變化。蒸制品中總黃酮含量最高,為(2.56±0.07) mg/g;灰棗生品中總多酚含量最高,為(66.73±1.22) mg/g;蒸制品中總三萜含量最高,為(46.56±1.62) mg/g。除總多酚外,蒸制品中總黃酮和總三萜含量均為最高。蒸制品對DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除能力,其IC50分別為1.36、0.27 mg/mL,VC對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的IC50分別為0.04、0.09 mg/mL,若羌灰棗蒸制品對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力始終低于VC。若羌灰棗蒸制品總還原力最高,但與VC的還原能力相比,若羌灰棗蒸制品還原能力始終低于VC。