陳麗靚,魯倩君,馬媛媛,劉 迎,趙寶龍,孫軍利

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832000 )

0 引 言

【研究意義】土壤鹽漬化影響作物生長(zhǎng)[1]。新疆鹽堿環(huán)境下一些葡萄品種黃化現(xiàn)象嚴(yán)重,喀什哈爾、木納格、和田紅是新疆南疆地區(qū)主栽品種,研究新疆南疆不同葡萄品種對(duì)NaCl脅迫的生理響應(yīng),評(píng)價(jià)供試葡萄品種的抗鹽性,對(duì)篩選出耐鹽性強(qiáng)的葡萄品種及耐鹽葡萄品種資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】當(dāng)土壤中的NaCl濃度達(dá)到一定程度時(shí),葡萄光合作用受到抑制,光合效率顯著降低[2-5],MDA含量降低[6],體內(nèi)活性氧大量積累,誘導(dǎo)有關(guān)保護(hù)酶類表達(dá)量增加,如過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等,清除過(guò)多的活性氧,減輕其傷害作用,使細(xì)胞膜維持穩(wěn)定,并提高植物的耐鹽性[7]。雷成軍等[8]研究發(fā)現(xiàn),隨著鹽分積累和脅迫時(shí)間延長(zhǎng),紅地球葡萄貝達(dá)嫁接苗SOD、POD、CAT活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。砧木間的耐鹽性因其自身遺傳特性不同存在差異,袁軍偉等[9]、牛銳敏等[10]、孫茜[11]、吳夢(mèng)曉等[12]、馬躍[13]、王連君等[14]等在不同葡萄砧木品種的耐鹽性鑒定分析中研究結(jié)果不一致,供試品種、環(huán)境條件和鑒定方法不同,所得結(jié)果也不盡相同?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前,有關(guān)不同砧木或不同葡萄品種耐鹽性比較研究較為廣泛,但不同品種與砧木進(jìn)行耐鹽性比較的試驗(yàn)較少,需分析與評(píng)價(jià)不同葡萄品種耐鹽性,分析鹽脅迫對(duì)不同葡萄品種的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以盆栽不同葡萄品種幼苗為材料,分析100 mmol/L NaCl脅迫對(duì)不同葡萄砧木植株鹽害指數(shù)、光合特性、抗氧化酶含量、丙二醛(MDA)含量的影響,為篩選葡萄抗鹽性品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用葡萄品種購(gòu)自山東省志昌葡萄研究所。試驗(yàn)地點(diǎn)位于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站。品種包括5BB、101-14、SO4、3309M、貝達(dá)、抗砧3號(hào)、喀什哈爾、木納格、和田紅、夏黑,共10種葡萄品種。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2021年4月將粗細(xì)均勻一致、充分成熟的一年生枝條(枝條長(zhǎng)度15～20 cm,含3～5個(gè)飽滿芽),分別移栽于18×18(cm)的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi),基質(zhì)配方為沙子∶蛭石∶草坪土=2∶2∶1[8],于石河子大學(xué)試驗(yàn)站進(jìn)行露天苗木培育。待幼苗長(zhǎng)到6～8片真葉時(shí),開(kāi)始進(jìn)行100 mmol/L NaCl鹽溶液處理[10]。

共設(shè)置2個(gè)處理:(1)對(duì)照(CK):澆灌清水;(2)NaCl處理(T):澆灌100 mmol/L NaCl。5 d澆灌1次,每次在19:00～20:00時(shí)澆灌,用量600 mL。每個(gè)處理5盆,重復(fù)3次。在鹽脅迫處理后第15 d分別選取葉部位新梢頂部以下第3～5片功能葉片測(cè)定其生理指標(biāo)。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)

1.2.2.1 鹽害指數(shù)

NaCl處理的第15 d調(diào)查對(duì)葡萄葉片的受害情況,觀察受害表現(xiàn),計(jì)算鹽害指數(shù)(SI),鹽害分級(jí)參照劉崇懷等[15]標(biāo)準(zhǔn)。

鹽害分為以下5個(gè)級(jí)別:

0級(jí):無(wú)鹽危害癥狀;

l級(jí):有少部分葉尖、葉緣或葉脈變黃;

2級(jí):約1/2的葉尖、葉緣焦枯;

3級(jí):大部分葉片有葉尖、葉緣焦枯和落葉現(xiàn)象;

4級(jí):枝枯、葉落、直至死亡。

鹽害指數(shù)(SI)=(1×S1+2×S2+3×S3+4×S4)/(4×總株數(shù))×100%。

式中,S為相應(yīng)鹽害級(jí)的株數(shù)。

1.2.2.2 光合氣體交換參數(shù)

NaCl處理第5 d選取植株葉部位新梢頂部以下第3片功能葉,采用LI-6400XT便攜式光合儀(美國(guó)LI-COR公司生產(chǎn))測(cè)定交換參數(shù):氣孔導(dǎo)度(Gs)、凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)等。

1.2.2.3 丙二醛(MDA)含量

NaCl處理第15 d選取葉部位新梢頂部以下第3～5片功能葉,采用TBA法[16]測(cè)定MDA含量。稱取葉片各1 g,加入少量石英砂和10%三氯乙酸2 mL,研磨至勻漿,再加8 mL 10%三氯乙酸進(jìn)一步研磨,以4 000 r/min離心10 min勻漿,其上清液為丙二醛提取液。取2支干凈試管編號(hào),各加入提取液2 mL,對(duì)照管加蒸餾水2 mL,各管再加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液。搖勻,混合液在沸水浴中反應(yīng)15 min,迅速冷卻后再離心。取上清液分別在532、600和450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值。

MDA濃度C(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450.

MDA含量(μmol/g FW)=C×V/W.

式中,V為提取液體積,W為樣品鮮重。

1.2.2.4 抗氧化酶活性

(1)CAT活性

過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用過(guò)氧化氫酶法測(cè)定[16]。取酶粗提取液50 μL于比色皿中,加入3 mL酶活性測(cè)定反應(yīng)液(包括2.0 mL 50 mmol/L pH 7.0的PBS,1.0 mL 0.067 mol/L的H2O2),用50μL 50 mmol/L pH 7.8的PBS代替酶液作為空白,立即用紫外分光光度計(jì)測(cè)定240 nm下的吸光度值并計(jì)時(shí),每隔1 min讀1次值。以1 min內(nèi)A240減少0.1酶量表示1個(gè)酶活單位U,計(jì)算CAT活性(U/(min·g))。

CAT活性(U/(min·g))=(A240×V1)/(0.1×V2×t×W).

式中,A240:為單位反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光值的變化;V1: 提取酶液總體積(mL);V2:測(cè)定時(shí)取用酶液體積(mL);t: 反應(yīng)時(shí)間(min);W:樣品鮮重(g)。

(2)POD活性

POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[17]測(cè)定。取酶粗提取液50 μL于比色皿中,加入3 mL酶活性測(cè)定反應(yīng)液(包括50 mmol/L pH 7.8的PBS,1.0 mL 0.6%的H2O2,1.0 mL 0.05 mol/L的愈創(chuàng)木酚),以50 μL 50 mmol/L pH 7.8的PBS代替酶液作為空白,立即用分光光度計(jì)測(cè)定470 nm下的吸光度值并計(jì)時(shí),每隔1 min讀1次值(讀0、1、2 min的吸光度值)。以1 min內(nèi)A470的增加表示1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位U,計(jì)算POD活性(U/(min·g))。

POD活性(U/(min·g)) =(A470×V1)/(0.01×V2×t×W).

式中,A470:單位反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光值的變化;V1: 提取酶液總體積(mL);0.01:1 min增加0.01為一個(gè)酶活單位;V2:測(cè)定時(shí)取用酶液體積(mL);t: 反應(yīng)時(shí)間(min);W:樣品鮮重(g)。

(3)SOD活性

SOD活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[18]測(cè)定。取酶粗提取液50 μL,依次加入1.5 mL 50 mmol/L的PBS(pH 7.8);0.3 mL 130 mmol/L的蛋氨酸;0.3 mL 750 μmol/L的NBT;0.3 mL 100 μmol/L的EDTA-Na2;0.3 mL 20 μmo/L的核黃素;0.25 mL蒸餾水。以不加入酶液(用緩沖液代替)的試管為最大光化還原管,將各管置于4 000 lx光照培養(yǎng)箱或日光燈下照光約20 min,用黑布遮光終止反應(yīng)。用PBS(pH7.8)調(diào)零,用分光光度計(jì)測(cè)定560 nm下的吸光度值。以1 min內(nèi)抑制光化還原50% NBT表示1個(gè)酶活性單位U,計(jì)算SOD活性(U/g)。

SOD活性(U/g)=(A光照-A560)×V1)/0.5×A光照×V2×W.

式中,A光照:光照管的吸光度值;A560:560 nm的吸光度值;V1酶提取液總體積(mL);0.5:抑制NBT 光化還原50%為1個(gè)酶活;V2: 測(cè)定時(shí)取用酶液體積(mL);W:樣品鮮重(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS26分析數(shù)據(jù),Microsoft Excel 繪制表格以及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 脅迫下不同葡萄品種鹽害指數(shù)比較

研究表明,100 mmol/L NaCl脅迫15 d,10個(gè)葡萄品種均出現(xiàn)不同程度的鹽害癥狀,和田紅、木納格、喀什哈兒、夏黑鹽害指數(shù)較低,分別為23.0%、25.0%、26.0%、30.0%;101-14、抗砧3號(hào)、貝達(dá)鹽害指數(shù)較高,分別為48.0%、50.0%、53.0%;而3309M、5BB、SO4鹽害指數(shù)最高,分別為63.0%、65.0%、70.0%。表1

2.2 NaCl脅迫下不同葡萄品種光合參數(shù)變化

研究表明,100 mmol/L NaCl處理5 d后降低了各葡萄品種葉片的凈光合速率(Pn),其中和田紅、木納格、夏黑和喀什哈爾降低幅度較小,鹽處理至5 d分別比各對(duì)照降低了31.84%、43.06%、47.28%和39.47%;101-14、抗砧3號(hào)和貝達(dá)較各對(duì)照相比降幅較為顯著,分別降低了56.00%、60.31%和64.08%;SO4、5BB和3309M降低幅度較大,分別比各對(duì)照顯著降低了72.15%、72.07%和68.16%。表2

NaCl脅迫下各葡萄品種氣孔導(dǎo)度(Gs)呈不同程度的降低趨勢(shì),100 mmol/L NaCl脅迫至5 d時(shí),和田紅、木納格、夏黑和喀什哈爾氣孔導(dǎo)度(Gs)降低幅度較小,分別比各對(duì)照降低了27.13%、48.84%、43.01%和61.44%;101-14、抗砧3號(hào)和貝達(dá)較各對(duì)照相比降幅達(dá)顯著性水平,分別降低了90.49%、101.32%和107.97%;SO4、5BB和3309M較各對(duì)照相比達(dá)顯著性水平,分別比各對(duì)照顯著降低了186.85%、161.87%和214.10%。

表1 鹽脅迫后15 d不同葡萄品種鹽害指數(shù)比較

NaCl脅迫下各葡萄品種胞間CO2濃度(Ci)呈不同程度的升高趨勢(shì),和田紅、木納格、夏黑和喀什哈爾胞間CO2濃度與各對(duì)照相比沒(méi)有顯著性差異;101-14、抗砧3號(hào)和貝達(dá)較各對(duì)照相比增幅達(dá)顯著性水平,分別顯著上升了20.50%、27.95%和21.09%;SO4、5BB和3309M較各對(duì)照相比達(dá)顯著性水平,分別比各對(duì)照顯著上升了35.29%、32.26%和30.14%。

NaCl脅迫下各葡萄品種蒸騰速率(Tr)呈不同程度的降低趨勢(shì),和田紅、木納格、夏黑和喀什哈爾蒸騰速率(Tr)降低幅度較小,分別比各對(duì)照降低了27.35%、27.95%、50.69%和53.08%;101-14、抗3和貝達(dá)較各對(duì)照相比降幅達(dá)顯著性水平,分別降低了109.53%、126.66%和104.27%;SO4、5BB和3309M較各對(duì)照相比達(dá)顯著性水平,分別比各對(duì)照顯著降低了265.47%、170.88%和169.44%。表2

表2 NaCl脅迫5 d下不同葡萄品種光合參數(shù)變化

2.3 NaCl脅迫下不同葡萄品種葉片抗氧化酶含量的變化

研究表明,100 mmol/L NaCl脅迫處理導(dǎo)致不同葡萄葉片抗氧化酶活性呈現(xiàn)不同程度的升高,其中和田紅、木納格、夏黑和喀什哈爾葉片的CAT酶活性較各對(duì)照相比達(dá)顯著性水平,分別顯著上升了49.08%、58.70%、44.60和50.39%;而5BB、3309M和SO4葉片的CAT酶活性較各對(duì)照相比,分別上升了27.86%、26.74%和36.96%;抗砧3號(hào)、101-14和貝達(dá)葉片的CAT酶活性較各對(duì)照相比達(dá)較顯著性水平,分別較各對(duì)照增加了37.28%、32.84%和36.62%。

100 mmol/L NaCl脅迫處理導(dǎo)致不同葡萄葉片POD含量呈現(xiàn)不同程度的升高,和田紅、木納格、夏黑和喀什哈爾葉片的POD酶活性分別較各對(duì)照相比顯著上升了44.21%、46.64%、68.06和58.81%,呈現(xiàn)顯著性差異變化;而5BB、3309M和SO4葉片的POD酶活性較各對(duì)照相比,分別上升了27.93%、22.66%和25.84%;抗砧3號(hào)、101-14和貝達(dá)葉片的POD酶活性較各對(duì)照相比達(dá)較顯著性水平,分別較各對(duì)照增加了39.45%、31.45%和31.84%。

100 mmol/L NaCl脅迫處理導(dǎo)致不同葡萄葉片SOD含量呈現(xiàn)不同程度的升高,和田紅、木納格、夏黑和喀什哈爾葉片的SOD酶活性分別較各對(duì)照相比顯著上升了56.63%、45.81%、43.23%和43.23%;而5BB3309M和SO4葉片的SOD酶活性較各對(duì)照相比,分別上升了21.86%、28.71%和25.27%;抗砧3號(hào)、101-14和貝達(dá)葉片的SOD酶活性較各對(duì)照相比達(dá)較顯著性水平,分別較各對(duì)照增加了38.29%、37.40%和32.36%。圖1

圖1 不同葡萄品種葉片CAT、POD、SOD含量變化

2.4 NaCl脅迫下不同葡萄品種葉片MDA含量的變化

研究表明,100 mmol/L NaCl脅迫處理導(dǎo)致不同葡萄葉片MDA含量呈現(xiàn)不同程度的升高,以和田紅、木納格、夏黑和喀什哈爾的升高幅度最小,與各對(duì)照相比沒(méi)有顯著性差異,而5BB、3309M和SO4葉片的MDA含量較各對(duì)照相比,分別顯著上升了41.71%、49.96%和57.10%;抗3、101-14和貝達(dá)的升高幅度與各對(duì)照相比有較顯著性差異,MDA含量分別上升了34.03%、36.51%和32.79%。圖2

圖2 不同葡萄品種葉片MDA含量變化

2.5 不同葡萄品種耐鹽性評(píng)價(jià)

研究表明,提取特征值>1的2個(gè)主成分,特征值分別為5.866、1.152,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為73.324%、87.722,具有較強(qiáng)信息代表性,達(dá)到分析要求。第一主成分在SOD、CAT、GS、POD、Tr上有較高的荷載量,第二主成分在CAT、GS、Ci、Tr、Pn上有較高的荷載量。表3

前2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)87.72%,選取前2個(gè)主成分作為抗鹽性分析的依據(jù),各綜合指標(biāo)的對(duì)應(yīng)特征向量為:

表3 主成分分析成分荷載矩陣

第1主成分:

Y1=0.400X1-0.885X2+0.391X3+0.384X4-0.380X5+0.373X6+0.319X7-0.012 4X8.

第2主成分:

Y2=-0.188X1-0.043 8X2+0.104X3+0.358X4-0.354X5+0.348X6+0.297X7-0.011X8.

式中,Y代表主成分,X1,2,3....代表各項(xiàng)成分值;

在第1主成分的表達(dá)式中,第1、3、4、6、7項(xiàng)的系數(shù)比較大,分別代表SOD、CAT、Gs、POD、Tr;在第2主成分的表達(dá)式中,第3、4、6、7項(xiàng)的系數(shù)比較大,分別代表CAT、Gs、POD、Tr。

綜合得分(F)是每個(gè)主成分得分與對(duì)應(yīng)貢獻(xiàn)率乘積之和,各品種在鹽脅迫下的排名為和田紅、木納格、喀什哈爾、夏黑、101-14、抗砧3號(hào)、貝達(dá)、5BB 、SO4、3309 M。表4

表4 10個(gè)葡萄品種主成分值及排序

3 討 論

葡萄具有較強(qiáng)的耐鹽性,但不同品種之間的耐鹽性存在差異,選用優(yōu)良的抗性砧木,可以明顯提高接穗品種的抗鹽性,在抵御逆境、病蟲(chóng)等方面發(fā)揮重要作用[9]。逆境脅迫下,植物鹽害指數(shù)與耐鹽率呈負(fù)相關(guān)[19]。研究表明,和田紅、木納格、夏黑和喀什哈爾鹽害指數(shù)最低,為耐鹽品種;抗砧3號(hào)、101-14和貝達(dá)鹽害指數(shù)較低,為較耐鹽類型;5BB、3309 M和SO4鹽害指數(shù)最高,為對(duì)鹽敏感類型。袁軍偉等[9]在21份葡萄砧木品種資源耐鹽性鑒定試驗(yàn)中表明,101-14為耐鹽類型,貝達(dá)為對(duì)鹽較敏感類型;牛銳敏等[10]在研究鹽脅迫對(duì)不同品種葡萄砧木生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)101-14為耐鹽類型,5BB、1103P耐鹽性中等,貝達(dá)、140R耐鹽性弱。同一葡萄砧木品種在不同試驗(yàn)中的耐鹽性也不相同[20-21]。

在NaCl脅迫下,葡萄砧木常表現(xiàn)為光合速率降低、氣孔阻力升高[3],體內(nèi)的活性氧大量積累,誘導(dǎo)有關(guān)保護(hù)酶類表達(dá)量增加[22],且耐鹽性弱的葡萄砧木MDA含量顯著高于耐鹽性強(qiáng)的葡萄砧木[23]。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),與各對(duì)照相比和田紅、木納格、夏黑和喀什哈爾葉片的Pn、Gs、Tr降低幅度最小,Ci和MDA含量上升幅度最小;101-14、抗砧3號(hào)和貝達(dá)葉片的Pn、Gs、Tr、Ci和MDA含量變化幅度較為顯著;SO4、5BB和3309 M葉片的Pn、Gs、Tr降低幅度最大,Ci和MDA含量上升幅度最大,與付晴晴等[22]在研究不同雜交砧木的耐鹽性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),耐鹽性強(qiáng)的A34砧木葉片的Pn、Gs、Tr含量均高于耐鹽性弱的B26砧木,而Ci含量相反的結(jié)果一致。NaCl脅迫下氣孔限制是導(dǎo)致葡萄凈光合速率降低的主要原因之一,而Ci上升,在這時(shí)期,非氣孔限制占了主導(dǎo)因素,可能是由于隨著NaCl脅迫加重,葉肉細(xì)胞受到損傷,葉綠體結(jié)構(gòu)破壞等原因造成的[24]。葡萄耐鹽光合生理特性較復(fù)雜,可能與品種耐鹽性、氣孔限制、葉綠體結(jié)構(gòu)破壞、光合電子傳遞、碳同化關(guān)鍵酶Rubisco活性、RuBP 再生能力等有關(guān)[25]。

郝玉杰等[26]在NaCl脅迫對(duì)2個(gè)葡萄品種生長(zhǎng)及生理特性的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),耐鹽性強(qiáng)的非洲黑玉只在NaCI濃度為4 g/L時(shí)的各項(xiàng)生理指標(biāo)與對(duì)照存在顯著性差異,而耐鹽性弱火洲紅玉則在各NaCl濃度處理下的各項(xiàng)生理指標(biāo)均與對(duì)照存在顯著性差異。葡萄的抗鹽能力與保護(hù)酶活性的大小是密切相關(guān)的[27-30]。

4 結(jié) 論

在NaCl脅迫下,與各對(duì)照相比,和田紅、木納格、喀什哈爾和夏黑四種葡萄的SOD、POD、CAT活性的增幅最大,而5BB、3309 M和SO4的SOD、POD、CAT活性的增幅最低;抗砧3號(hào)、101-14和貝達(dá)的SOD、POD、CAT活性的增幅較低,和田紅、木納格、喀什哈爾和夏黑為耐鹽品種;抗砧3號(hào)、101-14和貝達(dá)為中等耐鹽品種,5BB、3309 M和SO4為不耐鹽品種。