吳永祥盧瑋瑋蔣小旋江國慶程雪翔陳敏楠陳向陽

(1.黃山學院生命與環(huán)境科學學院，安徽 黃山 245041；2.黃山市新安醫(yī)學研究中心，安徽 黃山 245000；3.北京安汀醫(yī)藥生物科技有限公司，北京 101500；4.黃山曼迪新藥業(yè)有限公司，安徽 黃山 245700)

祁白術為菊科植物白術的干燥根莖，為安徽省著名道地藥材，與祁門紅茶、祁門蘄蛇齊名，是徽州“三祁”之一[1]。祁白術富含多酚、黃酮、揮發(fā)油、內(nèi)酯類物質和多糖等生物活性物質[2-5]，具有抑菌、抗氧化、抗炎癥、調節(jié)脂質代謝及免疫增強等現(xiàn)代藥理作用[6-8]。皖藥祁白術的“質優(yōu)效佳”與其特殊氣候、地形、土壤等生態(tài)環(huán)境因子密切相關[9]。多糖是祁白術中一種非常重要的次生代謝產(chǎn)物，是其發(fā)揮抗氧化、免疫調節(jié)等作用效果的物質基礎[8，10，11]。

目前，白術多糖的主要提取方法有熱水浸提法、酸提取法、超聲波提取法、酶法等。由于多糖大多包裹在植物細胞壁中，單一的傳統(tǒng)提取方法無法使細胞壁完全破裂，使多糖的溶出存在較大阻力，導致多糖得率低和提取成本高[12]。微波-超聲協(xié)同法是將微波和超聲波這2種作用結合的一種新的提取方法，具有提取時間短、能耗低和得率高等優(yōu)點[13]。目前，尚未見微波-超聲協(xié)同提取祁白術多糖的研究報道。因此，本試驗探討微波-超聲協(xié)同作用對祁白術多糖提取的影響，優(yōu)化提取工藝，并比較苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測定祁白術多糖含量的差異，旨在確定合理可行的祁白術多糖提取工藝和含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

祁白術，于2017年8月在安徽省祁門縣古溪鄉(xiāng)采集，經(jīng)黃山學院植物學專家方建新老師鑒定，確認為野生祁白術(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根莖；無水乙醇，分析純，上海玻爾化學試劑有限公司；苯酚，分析純，西隴化工股份有限公司；蒽酮，分析純，上?？曝S化學試劑有限公司；濃硫酸，分析純，西隴科學股份有限公司；葡萄糖，分析純，天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

數(shù)控加熱功率可調型超聲波清洗器，SCQ-5201C型，上海聲彥超聲波儀器有限公司；微波爐，ML-L213B型，美的集團股份有限公司；全波長酶標儀，SpectraMax-190型，美國Molecular Devices公司；電熱恒溫水浴鍋，HWS-28型，上海-恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 祁白術多糖的提取

取干燥充分的祁白術粉末2.0g，按照料液比1∶40g·mL-1加入蒸餾水，調節(jié)微波功率400W，時間設定為90s，然后進行超聲波處理，調節(jié)超聲溫度70℃，以150W的功率超聲10min。將提取液置于離心管中進行4000r·min-1離心15min，上清液即為祁白術多糖溶液。

1.3.2 苯酚-硫酸法測定多糖含量

參照Cuesta等[14]試驗方法，略有改進，取0.5mL樣品溶液于具塞試管中，加入0.5mL 5%苯酚溶液和2.5mL濃硫酸，搖勻，在沸水中反應10min，冷卻至室溫，準確吸取200μL溶液加入96孔酶標板，于490nm波長下測定吸光度。以葡萄糖為標準品，按照上述步驟，繪制標準曲線。

1.3.3 蒽酮-硫酸法測定多糖含量

參照謝心文等[15]試驗方法，略有改進，取0.5mL樣品溶液于具塞試管中，加入2.5mL蒽酮-硫酸溶液，搖勻，在沸水中反應10min，冷卻至室溫，吸取200μL溶液加入96孔酶標板，于500nm波長下測定吸光度。以葡萄糖為標準品，按照上述步驟，繪制標準曲線。

1.3.4 多糖提取率的計算

祁白術多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，提取率的計算公式：

式中，Y為祁白術多糖提取率，%；n為祁白術多糖溶液的稀釋倍數(shù)；C為根據(jù)標準曲線計算后的祁白術多糖溶液的質量濃度，g·mL-1；V為提取液的體積，mL；m為祁白術樣品的質量，為2.0g。

1.3.5 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法精確度試驗

1.3.5.1 2種方法反應物的吸收光譜

分別取苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法反應后的祁白術多糖及葡萄糖標準品溶液200μL于96孔酶標板，在400～740nm區(qū)域內(nèi)，每隔20nm波長掃描溶液的吸收曲線[16]。

1.3.5.2 穩(wěn)定性試驗

分別取苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法反應后的祁白術多糖溶液200μL于96孔酶標板，采用酶標儀對其進行時間-吸光度曲線掃描，掃描總時間為120min，每隔20nm掃描1次[16]。

1.3.5.3 標準曲線的制作

采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法分別測定不同濃度葡萄糖(100μg·mL-1、200μg·mL-1、300μg·mL-1、4000μg·mL-1、500μg·mL-1)的吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.5.4 加標回收率試驗

精密量取已知濃度的祁白術多糖溶液8份，分為2組加入試管中，在分別加入1mg·mL-1葡萄糖溶液0.1mL，采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法測定其吸光值，分別計算加標回收率[17]。

1.3.6 單因素試驗設計

各因素的試驗梯度分別為微波功率0W、100W、150W、400W、550W、700W；微波時間30s、60s、90s、120s、150s；超聲功率為0W、100W、150W、200W、250W、300W；超聲溫度50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。在進行單因素試驗時，除自身因素變化外，其他因素水平不變。

1.3.7 響應面試驗設計

在單因素基礎上，選擇微波功率(A)、微波時間(B)、超聲功率(C)、超聲溫度(D)為影響因子，多糖提取率(Y)作為評價指標，進行4因素3水平的響應面分析，因素水平見表1。

表1 因素水平

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及方差分析。運用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件中單因素方差分析的Duncan’s多重比較法分析數(shù)據(jù)間的顯著差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 吸收光譜的比較

由圖1可知，采用苯酚-硫酸法對祁白術多糖和葡萄糖進行測定時，祁白術多糖與葡萄糖在490nm波長處有明顯的最大吸收峰，且兩者的吸收曲線形狀一致，說明祁白術多糖在苯酚-硫酸作用下生成橙紅色化合物組分較單一，顯色效果較好。在蒽酮-硫酸法測定試驗中，祁白術多糖及葡萄糖標準品溶液在500nm左右出現(xiàn)較高吸收峰，但與苯酚-硫酸法相比，最大吸收峰不明顯，而且干擾峰較多。

注：1表示祁白術多糖；2表示葡萄糖。

2.2 穩(wěn)定性試驗結果的比較

由圖2可知，采用苯酚-硫酸法顯色的祁白術多糖吸收曲線在20min內(nèi)較為穩(wěn)定，但隨著時間的延長而出現(xiàn)較小波動，相對偏差為3.53%，分析原因可能是祁白術多糖與苯酚-硫酸作用生成的絡合衍生物易受外界因素(溫度、濕度、時間等)的影響。祁白術多糖與蒽酮-硫酸試劑顯色后，吸收曲線波動不大，在120min內(nèi)都較為穩(wěn)定，相對偏差為0.34%。

圖2 苯酚-硫酸法(a)和蒽酮-硫酸法(b)測定祁白術多糖的穩(wěn)定性比較

2.3 標準曲線試驗結果的比較

由圖3可知，蒽酮-硫酸法葡萄糖的回歸方程為Y=0.0025X+0.0209(R2=0.994)，苯酚-硫酸法葡萄糖的回歸方程為Y=0.0043X+0.0278(R2=0.999)。在100～500μg·mL-1范圍內(nèi)，苯酚-硫酸法的線性關系更好。

2.4 加標回收率試驗結果的比較

由表2可知，苯酚-硫酸法的平均回收率和標準偏差分別為100.38%、0.51%，均優(yōu)于蒽酮-硫酸法的104.82%、4.17%。通過上述試驗結果比較發(fā)現(xiàn)，苯酚-硫酸法測定祁白術多糖的線性關系、精密度及加樣回收率結果均優(yōu)于蒽酮-硫酸法，更適合于祁白術多糖的測定。本試驗選擇苯酚-硫酸法進行下一步祁白術多糖提取工藝的優(yōu)化試驗。

2.5 單因素試驗結果

2.5.1 微波功率對祁白術多糖提取效率的影響

固定微波時間90s、超聲功率150W、超聲溫度70℃，考察微波功率0W、100W、150W、400W、550W、700W對祁白術多糖提取率的影響，結果見圖4。微波功率為150W時，多糖提取率達到最大，為(38.50±0.18)%，而未進行微波處理組，多糖提取率僅為(26.24±2.38)%，多糖提取率顯著提高了46.71%，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。當微波功率超過150W時，祁白術多糖提取率隨著微波功率的增加而減少，可能是由于微波功率過高加速物料表面焦化，導致多糖溶出受阻[18]。

注：圖中不同字母表示在統(tǒng)計學上具有顯著差異(P<0.05)；下同。

2.5.2 微波時間對祁白術多糖提取效率的影響

固定微波功率400W、超聲功率150W、超聲溫度70℃，考察微波時間30s、60s、90s、120s、150s對祁白術多糖提取率的影響，結果見圖5。祁白術多糖提取率在微波時間達到60s時最大，為(39.62±2.21)%，之后多糖提取率隨著微波時間的增加而下降顯著(P<0.05)。

圖5 微波時間對祁白術多糖提取率的影響

2.5.3 超聲功率對祁白術多糖提取效率的影響

固定微波功率400W、微波時間90s、超聲溫度70℃，考察超聲功率為0W、100W、150W、200W、250W、300W對祁白術多糖提取率的影響，結果見圖6。超聲功率在0～200W范圍內(nèi)，多糖提取率隨著超聲功率的增大而增加，當超聲功率為200W時，多糖提取率達到最大，為(38.33±0.55)%，相比于未進行超聲處理組，多糖提取率顯著提高(P<0.05)。隨后，祁白術多糖提取率隨著超聲功率的增加而減少，可能是超聲功率過高致使多糖糖苷鍵斷裂、多糖結構破壞所致[19]。

圖6 超聲功率對祁白術多糖提取率的影響

2.5.4 超聲溫度對祁白術多糖提取效率的影響

固定微波功率400W、微波時間90s、超聲功率150W，考察超聲溫度50℃、60℃、70℃、80℃、90℃對祁白術多糖提取率的影響，結果見圖7。祁白術多糖提取率在溫度達到60℃時最大，為(36.70±1.26)%，之后多糖提取率隨著超聲溫度的升高而下降顯著(P<0.05)。

圖7 超聲溫度對祁白術多糖提取率的影響

2.6 響應面試驗結果

2.6.1 Box-Behnken實驗設計與結果分析

響應面試驗結果見表3。對表3數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到以下方程：

表3 祁白術多糖提取率的響應面試驗結果

Y=46.93+4.02A+2.32B-1.37C+2.29D+2.05AB-0.017AC+1.82AD-0.72BC-0.50BD+0.63CD-6.28A2-2.08B2-3.96C2-5.03D2

2.6.2 回歸模型的方差分析

表4 祁白術多糖提取率的回歸模型方差分析

2.6.3 驗證性試驗結果

根據(jù)統(tǒng)計分析結果，并考慮到生產(chǎn)操作的實際情況，優(yōu)化后的最佳提取工藝為微波功率400W、微波時間84s、超聲功率200W、超聲溫度63℃。通過驗證試驗，測得祁白術多糖提取率為48.53%，與預測值49.30%的相對誤差為1.59%，表明該方法穩(wěn)定可靠，預測性良好。

3 結論與討論

本試驗分別采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法對祁白術多糖含量的測定進行了比較，通過最大吸收波長掃描、線性關系、精密度及加樣回收率試驗發(fā)現(xiàn)苯酚-硫酸法準確可靠、重復性好，優(yōu)于蒽酮-硫酸法，更適合于祁白術多糖的測定。相比于高效液相色譜法、酶法等，苯酚-硫酸法操作簡單、樣品無需繁瑣前處理、檢測費用低、實用性強，具有更好的使用價值[20]。

本試驗通過響應面法優(yōu)化祁白術多糖的微波-超聲協(xié)同提取工藝，得到最佳工藝條件為微波功率400W、微波時間84s、超聲功率200W、超聲溫度63℃，多糖提取率高達48.53%。胡長玉等[21]采用傳統(tǒng)熱水浸提法提取祁白術多糖，通過正交設計分別優(yōu)化了祁白術水提及醇沉工藝，得到祁白術多糖提取率31.55%，低于本試驗結果的48.53%，表明微波-超聲協(xié)同提取工藝能顯著提高了祁白術多糖的提取效率。然而，不同產(chǎn)地白術的多糖、多酚、黃酮、揮發(fā)油和內(nèi)酯類物質等生物活性物質主要受產(chǎn)地環(huán)境的影響，其含量與種類差異顯著[22-24]，如浙江臨安白術多糖含量為24.93%、貴州余慶白術多糖含量為29.49%、湖北咸豐白術多糖含量為22.25%、四川產(chǎn)地白術多糖含量為34.30%。綜述所述，本試驗揭示了祁白術多糖的測定方法及優(yōu)化了微波-超聲協(xié)同提取工藝，為皖藥祁白術資源的綜合利用開發(fā)提供了一定的理論基礎。