陳華 黃彩翔 郭月仙 林怡 王義祥 劉朋虎

摘 要：為進一步了解鹿茸菇的生物學特性，篩選其適宜的母種培養(yǎng)基配方，設置了不同碳源、氮源、pH和溫度條件的篩選試驗，觀測鹿茸菇菌絲生長情況和菌絲顯微結構。結果表明：鹿茸菇母種培養(yǎng)基菌絲生長最適碳源為淀粉，最適氮源為硝酸鈉，最適pH值為7.0，最適菌絲生長溫度為25℃，鹿茸菇菌絲為雙核細胞，有鎖狀聯合，其細胞較長，不同生長時期隔膜明顯度不同。

關鍵詞：鹿茸菇；母種培養(yǎng)基；細胞核；顯微觀察

中圖分類號：S 646.9? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2023）02-0022-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.004

Abstract： In order to further understand the biological characteristics of Lyophyllum decastes and select the appropriate formula of mother culture medium， the screening tests of different carbon sources， nitrogen sources， pH and temperature conditions were set up to observe the mycelial growth and microstructure of Lyophyllum decastes. The results showed that the optimum carbon source was starch， the optimum nitrogen source was sodium nitrate， the optimum pH was 7.0， and the optimum temperature for the mycelial growth was 25℃. The mycelium of Lyophyllum decastes was a binuclear cell with clamp connection. Its cells were longer， and the visibility of cell membrane was different at different growth stages.

Key words： Lyophyllum decastes； Mother culture medium； Cellular nuclear； Microscopic observation

鹿茸菇學名為荷葉離褶傘Lyophyllum decastes，因其外形與鹿茸相似，故取名鹿茸菇[1]。鹿茸菇肉質厚實、口感脆滑，具有很高的食用和藥用價值，可以抑制癌細胞生長[2]，降低血糖、血壓等[3]，具有很好的應用前景。20世紀90年代日本首次室內栽培鹿茸菇，從2000年開始大量生產，2004年在日本寶酒造株式會社首次實現無覆土栽培[1]。國內許多學者先后對野生荷葉離褶傘子實體進行分離、人工馴化。1973年李植森曾利用蕨臺和茅草為培養(yǎng)料在林地內仿野生栽培研究[4]；2005年李林玉等[5]也對荷葉離褶傘菌絲營養(yǎng)條件進行了初步研究；2006年魏生龍等[6]利用PDA培養(yǎng)基上獲得了其子實體；2007年上海豐科生物科技股份公司首次在中國成功實現了荷葉離褶傘菌（FLd1）的工廠化栽培[7]，但還存在著發(fā)菌期較長、單瓶產量偏低的缺點。之后，隨著工廠化栽培技術的成功發(fā)展和管理技術的逐漸成熟，鹿茸菇產量穩(wěn)步增長。但由于鹿茸菇菌種難以維持，菌種迅速退化，導致栽培產量下降。此外，由于不同來源的鹿茸菇菌株其生長條件和生長速度有所差異，為了縮短鹿茸菇菌株的菌絲生長周期，提高鹿茸菇工廠化生產水平，探索其適宜培養(yǎng)條件，縮短栽培周期，提高栽培產量仍是未來研究的重點。為此，本研究通過對鹿茸菇菌絲生長最適碳源、氮源、pH和溫度等條件篩選以及菌絲顯微觀察展開研究，旨在明確鹿茸菇的生物學特性和其工廠化栽培技術的優(yōu)化提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試鹿茸菇菌株為Lyophyllum decastes LRX，來自寧德市益智源農業(yè)開發(fā)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方 PDA培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯40 g、蔗糖4 g、NaNO3 0.2 g和瓊脂4 g。

1.2.2 碳源配方篩選 試驗共選取7種碳源，分別為麥芽糖、蔗糖、玉米粉、淀粉、紅糖、白糖和果糖。試驗時配制含20 g·L-1的7種碳源PDA基礎培養(yǎng)基，分別分裝于試管中，并盡量使裝入的培養(yǎng)基液面保持相同高度，從而得到相同長度的培養(yǎng)斜面。121℃下高壓蒸汽滅菌20 min，然后擺斜面。冷卻后將活化好的母種菌絲，以相等的接種量接種到不同碳源斜面培養(yǎng)基上，每種碳源接5根試管，做好標記。25℃下恒溫、避光培養(yǎng)復蘇，待菌絲在培養(yǎng)基上生長后，同一天給不同碳源畫一條基準線，繼續(xù)培養(yǎng)20 d，期間每隔5 d畫一次線，觀察和記錄這20 d的生長情況，包括長勢、色澤、平均生長速度，比較不同碳源的生長情況。

1.2.3 氮源配方篩選 氮源配方篩選是在基礎培養(yǎng)基中分別添加1 g·L-1的酵母粉、牛肉浸膏、谷氨酸、NH4Cl、NaNO3作為氮源，每種氮源重復5次。參照1.2.2進行接種和生長情況觀察。

1.2.4 最適pH篩選 試驗共設pH4、5、6、7、8和9等6個水平，每個處理重復5次。試驗基礎培養(yǎng)基選用的碳源、氮源分別為蔗糖和NaNO3。利用1 mol·L-1 NaOH或1 mol·L-1 HCl調節(jié)培養(yǎng)基至相應的pH條件，然后參照1.2.2的方法進行接種和生長情況觀察。

1.2.5 最適溫度篩選 試驗設19℃、22℃、25℃、28℃、29℃、30℃和31℃等7個溫度條件，基礎培養(yǎng)基同pH篩選試驗，每個處理重復5次。接種后分別放在不同溫度的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，待復蘇后對不同溫度培養(yǎng)下的菌絲在同1 d畫一條基準線，繼續(xù)培養(yǎng)20 d，期間每隔5 d畫一次線，記錄20 d的生長速度和生長情況。

1.2.6 菌絲細胞核數量觀察 將鹿茸菇菌種接種在插有蓋玻片的平板培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)，待菌絲爬上蓋玻片的1/3面積后，即可通過DAPI染料染色，然后在正置熒光顯微鏡下觀察菌絲的細胞核數量。

1.3 數據分析

試驗數據采用Excel 2010軟件進行數據處理；采用SPSS 19.0軟件中Duncan多重性方法分析不同處理間的差異顯著性，數據均為5個重復的平均值±標準偏差（平均值±SD，n=5，顯著P<0.05，極顯著P<0.01）。

2 結果與分析

2.1 碳源對鹿茸菇菌絲生長的影響

由表1、圖1可知，鹿茸菇菌絲對8種碳源均能利用，菌絲均呈現出稠密，潔白，但也存在一定的差異。不同碳源對鹿茸菇菌絲的生長速度影響不同，依次為麥芽糖>淀粉>玉米粉>蔗糖>葡萄糖>白糖>紅糖>果糖。麥芽糖作為碳源菌絲生長速度最快，但菌絲的稠密度不及淀粉；淀粉作為碳源菌絲生長速度第2，但從菌絲的生長稠密程度上看是最密的，麥芽糖與淀粉作為碳源菌絲生長速度差異不顯著；玉米粉作為碳源菌絲的生長速度較快，但菌絲生長較稀疏；蔗糖、葡萄糖、白糖、紅糖作為碳源菌絲的生長速度差異不顯著；果糖作為碳源菌絲的生長速度最慢。綜上，淀粉作為碳源對鹿茸菇菌絲生長是最佳的。

2.2 氮源對鹿茸菇菌絲生長的影響

由表2、圖2可知，鹿茸菇菌絲對NaNO3、牛肉浸膏、酵母粉、谷氨酸、NH4Cl這5種氮源都能利用，菌絲生長速度依次為NaNO3>牛肉浸膏>酵母粉>谷氨酸>NH4Cl。從菌絲的疏密程度上看，以NaNO3為氮源菌絲最密；牛肉浸膏和酵母粉為氮源菌絲的疏密程度比NaNO3稍差；以谷氨酸、NH4Cl為氮源的菌絲生長緩慢，但菌絲較為密集。NaNO3、牛肉浸膏作為氮源菌絲生長速度顯著高于其他3種，綜合菌絲生長速度和疏密程度，NaNO3作為氮源對鹿茸菇菌絲生長是最佳的。

2.3 pH對鹿茸菇菌絲生長的影響

由表3、圖3可知，鹿茸姑菌絲在pH值為4、5、6、7、8、9的培養(yǎng)基上都能生長，其中pH值為7時生長速度最快，菌絲生長濃密，潔白，棉絮狀，整齊，不往試管壁上生長；pH值為6時菌絲生長濃密，潔白，棉絮狀，向試管壁上生長嚴重；pH值為8時菌絲生長較為濃密，潔白，棉絮狀，較整齊，菌絲向試管壁上生長較嚴重；pH值為9時菌絲生長濃密，潔白，棉絮狀，整齊，菌絲往試管壁上生長的程度較輕；pH值為5時菌絲生長較稀疏，白色，棉絮狀但不是很明顯，往試管壁上生長的程度較輕；pH值為4時由于培養(yǎng)基凝固程度不高，菌絲生長稀疏，白色，往試管壁上生長嚴重。綜上，培養(yǎng)基pH值為7時最適鹿茸姑菌絲生長。

2.4 溫度對鹿茸菇菌絲生長的影響

由表4、圖4可知，鹿茸菇菌絲在供試溫度中，生長狀況最好的是25℃，致死溫度是31℃ ，該品種鹿茸菇不適宜超過29℃的高溫下生長。25℃下菌絲生長速度最快，且菌絲濃密；22℃下菌絲生長速度比25℃下的生長速度慢，菌絲濃密；19℃下菌絲生長速度比22℃下的生長速度慢，且其菌絲的濃密程度也比不過22℃下生長的菌絲濃密；菌絲在28℃下的生長速度明顯有所下降，但菌絲生長仍濃密；29℃和30℃下生長的菌絲，前期能夠萌發(fā)生長，但10 d后可以明顯地看到接種塊有些發(fā)黃，菌絲生長速度緩慢。

2.5 鹿茸菇菌絲細胞核數量觀察

菌絲是食用菌的營養(yǎng)器官，通過分解吸收營養(yǎng)物質、水分、無機鹽類和有機物質等供給自己生長發(fā)育。菌絲細胞又是食用菌的基本組成單位，也是菌種鑒別的重要參考依據。由圖5可知，鹿茸菇菌絲是雙核細胞，有鎖狀聯合，其細胞較長，不同生長時期隔膜明顯度不同。通過5 ug·mL-1 DAPI染料染色，在正置熒光顯微鏡40倍物鏡下觀察菌絲的染色情況，可以在目鏡中看到細胞核發(fā)藍色至淺綠色熒光，有時會發(fā)黃色熒光，原因是稀釋DAPI染料的磷酸鹽緩沖液會隨DAPI染料進入菌絲細胞中，細胞中的多聚磷酸顆粒與DAPI結合，在紫外激發(fā)光下會發(fā)黃色熒光。

3 討論與結論

碳源、氮源、pH和溫度等均是食用菌菌絲生長的營養(yǎng)因子，為了簡化配方篩選指標，大多研究者選擇碳氮比作為配方篩選的關鍵因子進行研究，易忽略pH和溫度指標對菌絲生長的影響。鹿茸菇栽培起步晚，栽培技術不夠完善，生物學特性研究不夠健全，需要進一步加大基礎性指標研究。因此，通過碳源、氮源、pH和溫度等生長因子的篩選對基礎研究具有重要參考價值。本試驗從碳源配方篩選中得出，麥芽糖配方菌絲生長速度最快，淀粉配方第2與麥芽糖配方菌絲長速無顯著差異，但淀粉配方菌絲色澤和長勢優(yōu)于麥芽糖配方。有研究表明，淀粉作為碳源添加于培養(yǎng)基中，對榆干離褶傘、羊肚菌和杏鮑菇菌絲長勢發(fā)揮重要作用[8-10]。從氮源配方篩選中得出，鹿茸菇菌絲對有機氮和無機氮均能利用，結果表明無機氮NaNO3更適合鹿茸菇菌絲生長，有機氮中牛肉浸膏菌絲生長效果最好。周會明等[11]對荷葉離褶傘配方篩選表明，菌株ZY01、ZY02及ZY03的最適碳源是蔗糖，最適氮源是蛋白胨，而菌株ZY04和ZY05最適碳源是葡萄糖，最適氮源是蛋白胨。說明不同菌株對碳源和氮源的需求具有差異性。鹿茸菇屬中溫型菌類，菌絲在19～30℃下均能生長，且隨著溫度的提高，生長速度出現“低促高抑”趨勢，25℃下菌絲生長速度最快，菌絲色澤潔白，長勢最密；在31℃下培養(yǎng)，菌絲停止生長。pH在6～8范圍內生長較好，pH為7時是最佳酸堿度。鹿茸菇菌絲生長溫度與張凌姍[12]的研究較為一致，而pH略有差異。

在觀察鹿茸菇菌絲細胞核過程中，其菌絲生長時間會影響到觀察結果，一般培養(yǎng)10 d左右為宜。觀察時盡量將視野移動到菌絲尖端位置，由于菌絲尖端分裂旺盛，更可能觀察到完整細胞和里面的細胞核。另外，在利用正置熒光顯微鏡觀察時，每次使用的時間需控制在1～2 h，因為超過90 min后，超高壓汞燈發(fā)光強度會逐漸下降，發(fā)出的熒光減弱。同時，標本局部受到紫外線照射3～5 min后，熒光也會明顯減弱，需要不停地移動觀察。整個標本的觀察時間在40 min左右熒光會淬滅。不同濃度的DAPI染料，其穿透性不同，因此需要根據不同樣本選擇不同的濃度，染色出來的熒光才清晰。食用菌菌絲具有鎖狀聯合，都可以判斷為雙核菌絲，但并不是所有的雙核菌絲一定具有鎖狀聯合結構[13]。本研究通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現，鹿茸菇菌絲屬于雙核菌絲，并有鎖狀聯合結構發(fā)生，一方面為工廠化栽培鹿茸菇奠定了理論基礎，另一方面豐富了鹿茸菇生物學特性及開展雜交育種、優(yōu)良菌株篩選提供參考。

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（責任編輯：柯文輝）