胡甜 葉蘇梅 郝璦瀅 王藝潤 韓浩章 張穎 王曉李 張麗華

摘要 為研究猴樟CbMYB308蛋白的序列結構和功能，該文克隆猴樟CbMYB308基因CDS序列，進行生物信息學分析。結果表明，克隆得到的序列具有1個942 bp完整的ORF框，編碼313個氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR91885.1基因序列一致性達97.29%，系統(tǒng)進化樹的結果表明，猴樟CbMYB308蛋白具有較高的保守性；猴樟CbMYB308蛋白生物信息學分析結果表明，CbMYB308蛋白具有PLN03091家族結構域，為R2R3-MYB型轉錄因子，CbMYB308蛋白化學分子式為C1496H2356N432O489S11，相對分子量34.57 kDa，理論等電點6.12，結構不穩(wěn)定，無序化特征明顯，為脂溶性和親水性蛋白，磷酸化氨基酸位點有53個，亞細胞定位預測為細胞核。

關鍵詞 猴樟；轉錄因子；基因克??；生物信息學分析

中圖分類號 S792.23 文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）03-0014-04

猴樟（Cinnamomun bodinieri Levl.）為樟科樟屬常綠喬木，主要分布于我國南方地區(qū)，是我國重要的精油加工樹種、綠化樹種和林用樹種。我國關于猴樟的研究主要集中于精油資源、林用特性、組培技術和引種栽培等方面，近年來的研究表明，猴樟的生長速度和抗寒性優(yōu)于香樟[1]，可以替代香樟在我國北方地區(qū)推廣應用。很早就進行了香樟新品種選育工作，相繼選育出涌金、霞光、御黃等彩葉品種[2-4]，然而，關于猴樟彩葉新品種選育較少。研究表明，花青素種類、組成及其代謝調控是植物葉片呈色的關鍵因素，而花青素代謝主要受轉錄因子MYB、bHLH、WD40及其復合物的調控[5]，其中MYB類轉錄因子調控功能研究最受關注，本研究基于轉錄組數據篩選出調控植物花青素合成的轉錄因子，并分析其特性，以期為猴樟新品種選育提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為猴樟變種（春季葉色為紅色）2年生種苗，于2019年3月上旬播種，2021年3月上旬進行移栽。于2021年8月20日，取猴樟枝條頂部幼嫩葉片進行液氮速凍后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）試劑盒提取材料的總RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）方法去除基因組DNA后，用TR Prime Mix（random primer）進行反轉錄反應，獲得的cDNA產物作為模板。

1.2 基因克隆

根據猴樟轉錄組數據，獲得在紅葉猴樟變種葉片中上調表達的MYB轉錄因子基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計CDS擴增引物[F（5′—3′）：AGAATGGGAAGAGCGCC；R（5′—3′）：TCAA TCTACAAGCTTCTTATGC]，PCR反應采用25 μL體系[6]，反應產物直接轉化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細胞（TSINGKE，北京），挑單菌落進行PCR鑒定，將PCR陽性菌落培養(yǎng)后，提取質粒送擎科生物技術有限公司測序。

1.3 生物信息學分析

通過ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）將猴樟CbMYB308基因翻譯成蛋白序列；利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白結構域預測；利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）對氨基酸序列的理化性質和等電點進行分析；采用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）進行蛋白質的親/疏水性預測；采用PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）在線軟件進行蛋白二級結構分析；利用Fold Index軟件（https：//fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex）分析氨基酸折疊無序化特性分析；采用SoftBerry ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/）和Cell-PLoc 2.0在線分析軟件（http：// www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進行蛋白亞細胞定位；采用Swiss-Model（http：//www.Swissmodel.expasy.org）預測蛋白質三級結構，并利用PyMOL軟件生成三級結構模型；利用MEGA7.0生成與CbMYB308的CDS序列同源性較近的物種序列進化樹。

2 結果與分析

2.1 猴樟CbMYB308基因的克隆與重組載體構建

根據克隆后的凝膠電泳圖（圖1），以猴樟的cDNA為模板，通過PCR擴增得到1條約1 000 bp的條帶，片段大小與預期一致，通過測序得到長942 bp的CDS序列。PCR產物送公司測序，測序結果與沉水樟中收錄的RWR91885.1基因進行比對，序列一致性高達97.29%，具備MYB轉錄因子的功能。將克隆獲得的基因編碼蛋白通過NCBI BLAST Protein與數據庫進行比對，根據比對結果顯示，所克隆得到的序列具有1個942 bp完整的ORF框，推導編碼313個氨基酸，將獲得的目的基因命名為CbMYB308。

2.2 猴樟CbMYB308蛋白的生物信息學分析

2.2.1 猴樟CbMYB308蛋白的理化性質分析。利用Protparam軟件對猴樟CbMYB308蛋白的理化性質進行分析，猴樟CbMYB308蛋白相對分子量34.57 kDa，理論等電點6.12，表明CbMYB308基因編碼蛋白為弱酸性，化學分子式為C1496H2356N432O489S11，原子總數為4 784，不穩(wěn)定指數值為48.55，不穩(wěn)定系數大于40時為不穩(wěn)定蛋白，因而該蛋白質是不穩(wěn)定的。脂溶指數為66.77，CbMYB308基因編碼蛋白為脂溶性蛋白，帶負電荷的殘基（asp+glu）總數為39，帶正電荷的殘基（arg+lys）總數為36。利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白結構域預測，結果表明（圖2），CbMYB308蛋白具有PLN03091家族結構域，具備R2R3-MYB型轉錄因子。利用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）對猴樟CbMYB308基因編碼蛋白的親水性進行分析（圖3），總平均親水性值（GRAVY）為-0.568，預測該蛋白為親水性蛋白。蛋白質親水性分析對于研究其跨膜特征和二級結構有著重要的指導意義，通常認為，氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強。猴樟CbMYB308基因編碼蛋白各氨基酸序列中第267位氨基酸分值最低為-2.556，親水性值最強；第303位氨基酸分值最高，為2.089，疏水性最強，就整體分析而言，親水性氨基酸均勻分布在整個多膚鏈中，沒有明顯的疏水性區(qū)域，因此，推測猴樟CbMYB308基因編碼蛋白為親水性蛋白。

2.2.2 猴樟CbMYB308蛋白二、三級結構預測。蛋白亞細胞定位結果表明該蛋白定位于細胞核。根據蛋白二級結構在線預測結果（圖4），該蛋白的組成為122個氨基酸（38.98%）為α-螺旋、39個氨基酸（12.46%）為延伸主鏈，23個氨基酸（7.35%）為β轉角及129個氨基酸（41.21%）為隨機卷曲，因而猴樟CbMYB308主要由α-螺旋和隨機卷曲組成；蛋白質中二硫鍵橋的可能數量為76種不同組合。利用Fold Index對猴樟CbMYB308蛋白進行氨基酸序列折疊無序化分析（圖5），結果表明，該蛋白存在7個氨基酸無序化區(qū)域，共包含178個氨基酸，折疊無序化比例為56.87%，折疊無序化指數為0.056，無序化特征明顯。蛋白磷酸化位點進行預測結果（圖6），該多肽鏈0.500以上分值的氨基酸位點為53個，其中包含36個絲氨酸（S）、15個蘇氨酸（T）和2個酪氨酸（Y）磷酸化位點。根據蛋白三級結構預測結果和同源建模分析（圖7），CbMYB308編碼蛋白三級結構與PDB：1a5j.1.A的氨基酸序列一致性達46.23%，1a5j.1.A序列的編碼蛋白R2R3-MYB轉錄因子。

2.2.3 猴樟CbMYB308蛋白序列同源比對及系統(tǒng)進化樹。在NCBI數據庫中對猴樟CbMYB308蛋白序列進行blastp比對，根據結果下載比對得分較高的氨基酸序列，再通過MEGA7.0軟件構建CbMYB308蛋白系統(tǒng)進化樹（圖8）。結果表明，猴樟CbMYB308蛋白在進化樹上與同為樟科樟屬的沉水樟聚為一類，說明其親緣關系最近，樟科樟屬植物中該類蛋白具有較高的保守性。猴樟CbMYB308蛋白進化樹中大概分3類，其中猴樟與沉水樟、博落回歸為一類，其次是麻雀花、流蘇馬兜鈴、藍星睡蓮和盧旺達睡蓮歸為一類，與猴樟親緣關系更遠的深圳擬蓮、椰子、鐵皮石斛和鼓槌石斛歸為一類。

3 結論與討論

MYB轉錄因子對花青素生物合成包括正調控和負調控2個方面，其中起正調控作用的主要是R2R3-MYB蛋白S6亞組，該亞組具有保守的“KPRPR[S/T]F”基序，光照、溫度、糖、激素等均能誘導R2R3-MYB轉錄因子表達，從而促進花青素合成[7]。MYB轉錄因子對花青素生物合成調控具有組織特異性，是人們研究的重點，本研究結果表明，克隆得到的序列具有1個942 bp完整的ORF框，編碼313個氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR91885.1基因序列一致性達97.29%，系統(tǒng)進化樹的結果表明，猴樟CbMYB308蛋白具有較高的保守性，與前期研究結果一致[7]；猴樟CbMYB308蛋白生物信息學分析結果表明，CbMYB308蛋白具有PLN03091家族結構域，為R2R3-MYB型轉錄因子，亞細胞定位預測為細胞核，結合表型來看，只在葉片顯示紅色，而在莖、花、根中不顯示紅色，說明CbMYB308具有明顯的組織特異性，研究結果為進一步進行猴樟葉片花青素合成途徑及其調控網絡研究提供了基礎。

4 參考文獻

[1] 韓浩章，張麗華，王曉立，等. 猴樟與香樟幼苗的耐鹽堿性比較[J]. 西部林業(yè)科學，2019，48（05）：7-14.

[2] 王建軍. 香樟新品種‘涌金[J]. 林業(yè)科學，2010，46（08）：181.

[3] 王建軍. 香樟新品種‘霞光[J]. 林業(yè)科學，2015，51（06）：163.

[4] 王豪，張波，陸云峰，等. 香樟新品種‘御黃[J]. 園藝學報，2019，46（S2）：2924-2925.

[5] 王欣，張?zhí)熘? 園藝作物花青素合成調控研究進展[J]. 生物技術進展，2022，12（01）：10-16.

[6] 韓浩章，張麗華，李素華，等. 猴樟CbP5CS1基因克隆及表達載體構建[J/OL]. 分子植物育種：1-9.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210720.1751.012.html.

[7] Stracke R，Werber M，Weisshaar B. The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana.[J]. Current Opinion in Plant Biology，2001，4（5）：447-456.

（責編：王 菁）

基金項目 宿遷學院2020年優(yōu)秀論文培育團隊項目；江蘇省自然科學基金（BK20201481）；宿遷市科技計劃（M202001）；宿遷市科技計劃（L202004）；宿遷學院創(chuàng)新團隊項目（2021td05）。

作者簡介 胡甜（1998—），女，江蘇南通人。研究方向：樟屬植物研究與應用。

韓浩章*通信作者

收稿日期 2022-03-23