李婧　劉海燕　蒙文萍　周穎　楊朔　周艷

關(guān)鍵詞：大王杜鵑：根際土壤：細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)：高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：S685.21：Q938.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2023）03-0095-06

杜鵑屬（Rhododendron L.）是杜鵑花科（Eri-caceae）最大的一個(gè)屬，杜鵑屬植物通常被稱為杜鵑花，目前全世界約有千余種，廣泛分布于亞洲、歐洲和北美洲，主產(chǎn)東亞和東南亞地區(qū)。我國(guó)擁有最為豐富的野生杜鵑花資源，西南地區(qū)更是杜鵑花多樣化和多度中心，約有410種，但由于分布狹窄、生境遭受破壞、種群繁衍困難等原因，部分種類的野生杜鵑花資源日益稀缺。大王杜鵑（Rhododendron rex）是野生杜鵑花中較為珍稀的一種，僅分布在西南地區(qū)海拔2300～3300米的山坡林中，是我國(guó)特有的珍稀原始古老物種，被《中國(guó)生物多樣性紅色名錄——高等植物卷》和《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》列為易危（vulnerable）等級(jí)，《中國(guó)植物紅皮書——稀有瀕危植物》中被收錄為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)植物。珍稀瀕危植物的遺傳學(xué)研究一直是討論熱點(diǎn)，相關(guān)研究有助于深層次了解物種進(jìn)化史和瀕危機(jī)制，進(jìn)而有效保護(hù)瀕危物種，但物種的遺傳變異不僅與類群分布有關(guān)，還受類群的起源、進(jìn)化、生物學(xué)特性及生境條件等因素影響，所以相關(guān)研究需要建立在對(duì)珍稀瀕危物種生境條件充分了解的基礎(chǔ)上。

土壤是植物生境的重要組成部分，土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的主要分解者，對(duì)土壤質(zhì)量的改良和養(yǎng)分循環(huán)的促進(jìn)具有重要作用。根際是植物根系周圍受根系生長(zhǎng)影響的土體，是微生物與宿主植物之間發(fā)生相互作用的一個(gè)微小區(qū)域，在這個(gè)微小區(qū)域中蘊(yùn)含著豐富的微生物資源。細(xì)菌則是這些微生物資源中數(shù)量最多、種類最豐富的類群，有些細(xì)菌可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害，被稱為根際促生菌（PGPR），有些則會(huì)抑制植物的正常生長(zhǎng)。為了探明大王杜鵑生長(zhǎng)與其根際土壤細(xì)菌之間的互作關(guān)系，本研究選取野生大王杜鵑根際土壤作為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序（Illumina MiSeq）技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌16S rRNA的V3-V4區(qū)片段進(jìn)行測(cè)序，擬從分子水平揭示野生大王杜鵑根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，為今后開(kāi)展大王杜鵑的根際促生菌分離篩選、人工培育及瀕危機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集

土壤樣品于2021年4月采自云南轎子山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（102°49′56″E，26°4′7″N）。以野生大王杜鵑植株生長(zhǎng)點(diǎn)為中心，分別采集5～10、10～15、15～20 cm深度范圍的土壤，去除根系外圍土壤后采用抖落法輕輕抖落須根上4 mm的土壤作為樣品，一個(gè)深度范圍為一個(gè)樣品，共3個(gè)樣品，分別裝入無(wú)菌自封袋，標(biāo)記為DW-10 cm、DW-15 cm、DW-20 cm，干冰保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-80℃低溫冰箱中保存，備用。

1.2根際土壤細(xì)菌基因組DNA提取、擴(kuò)增與測(cè)序

采用OMEGA土壤DNA提取試劑盒（E.Z.N.A^TMMag-Bind Soil DNA Kit）提取樣品總DNA，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書。

PCR擴(kuò)增分兩輪進(jìn)行，以提取到的樣品總DNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，采用上游引物341F（5′- CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和下游引物805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3-V4區(qū)片段，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（30μL）：2xHieff Robust PCR Master Mix 15μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板1μL，加水至30μL。擴(kuò)增程序；94℃3 min；940C 30 s，45℃ 20 s，65℃30 s，循環(huán)5次；94℃20s，55℃20 s，72℃ 30 s，循環(huán)20次；72℃5 min，19℃保溫：以第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，用P5（5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3′）和P7（5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3′）引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系（30μL）：2×Hieff Robust PCR Master Mix 15μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，加水至30μL。擴(kuò)增程序：95℃3 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，循環(huán)5次；72℃5 min，10℃保溫。

經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格后由生工生物工程（上海）股份有限公司采用Illumina MiSeq二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

通過(guò)高通量測(cè)序獲得的原始測(cè)序序列經(jīng)FLASH和和Trimmomatic軟件進(jìn)行拼接和質(zhì)量過(guò)濾后，再經(jīng)Usearch和UCHIME去除非擴(kuò)增區(qū)域序列和嵌合體序列，最終獲得高質(zhì)量有效序列。使用QIIME軟件將各樣品的全部有效序列進(jìn)行聚類，相似閾值≥97%的序列聚類為一個(gè)操作分類單元（OTU） ，并使用Mothur軟件進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性分析。使用FAPROTAX數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)根際土壤細(xì)菌功能，Microsoft Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)及制作圖表。

2結(jié)果與分析

2.1根際土壤DNA的提取

提取結(jié)果表明，DNA條帶清晰明亮，說(shuō)明提取片段完整，可用于后續(xù)分析。使用Qubit 3.0熒光定量?jī)x對(duì)DNA濃度進(jìn)行測(cè)定，3個(gè)樣品的DNA濃度分別為41.6、26.6、28.4 ng/μL，濃度適宜，可滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2根際土壤測(cè)序結(jié)果

通過(guò)對(duì)各樣品細(xì)菌16S rRNA的V3-V4區(qū)片段進(jìn)行高通量測(cè)序，共獲得原始序列235 331條，質(zhì)控后得到有效序列230 150條，基于≥97%的相似閾值對(duì)有效序列進(jìn)行聚類后共獲得958個(gè)OTU，各樣品測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表1。使用OTU稀釋曲線對(duì)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果（圖1）表明，各樣品OTU稀釋曲線均逐漸趨于平緩，說(shuō)明此次測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，物種分布均勻，能夠反映大王杜鵑根際土壤細(xì)菌群落物種多樣性。

2.3根際土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性

Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)表征細(xì)菌群落的豐度大小，數(shù)值越大表明樣品中物種種類越多；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征細(xì)菌群落的多樣性高低，Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小表明樣品中物種多樣性越高。由表2可知，DW-20 cm樣品的Shannon指數(shù)、Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)均最大，說(shuō)明15～20 cm深度范圍的大王杜鵑根際土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性最大。

2.4根際土壤細(xì)菌群落組成

通過(guò)對(duì)各樣品細(xì)菌16S rRNA的V3-V4區(qū)片段進(jìn)行高通量測(cè)序并聚類后，共獲得958個(gè)OTU，隸屬于19門54綱83目140科188屬。從門分類水平來(lái)看（圖2a），大王杜鵑根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群主要分屬于6個(gè)門，占比89.67%，依次為變形菌門（Proteobacteria，38.47%）、酸桿菌門（Ac-idobacteria，24.87%）、放線菌門（Actinobacteria，13.90%）、浮霉菌門（Planctomycetes，7.57%）、綠彎菌門（Chloroflexi，2.58%）、疣微菌門（Verru-comicrobia，2.28%）。

從綱分類水平來(lái)看（圖2b），相對(duì)豐度大于1%的共有12個(gè)，占比86.73%，依次為α-變形菌綱（Al-phaproteobacteria，30.78%）、放線菌綱（Actinobacteria，13.78%）、酸桿菌綱亞群2（Acidobacteria Gp2，8.96%）、浮霉菌綱（Planctomycetia，7.56%）、酸桿菌綱亞群1（Acidobacteria Gpl，7.43%）、酸桿菌綱亞群3（Acidobacteria Gp3，4.89%）、γ-變形菌綱（Gamma-proteobacteria，4.50%）、纖線桿菌綱（Ktedonobacteria，2.40%）、酸桿菌綱亞群6（Acidobacteria Gp6，1.99%）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria，1.65%）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria，1.49%）、斯巴達(dá)桿菌綱（Sparto-bacteria，1.30%）。

從目分類水平來(lái)看（圖2c），相對(duì)豐度大于1%的共有16個(gè)，占比82.38%，其中相對(duì)豐度較大的8個(gè)目依次為根瘤菌目（Rhizobiales，22.50%）、Norank Acidobacteria Gp2（8.96%）、浮霉菌目（Planctomycetales，7.50%）、Norank AcidobacteriaGpl（7.43%）、放線菌目（Actinomycetales， 7.29%）、紅螺菌目（ Rhodospirillales，6.41%）、Norank Ac-idobacteria Gp3 （4.89%）、酸微菌目（Acidimicrobi-ales，3.46%）。

從科分類水平來(lái)看（圖2d），相對(duì)豐度大于1%的共有21個(gè)，占比76.48%，其中相對(duì)豐度較大的8個(gè)科依次為Unclassified Rhizobiales（11.67%）、Norank Acidobacteria Gp2（8.96%）、浮霉菌科（Planctomycetaceae，7.50%）、Norank Ac-idobacteria Gpl（7.43%）、慢生根瘤菌科（Bradyrhi-zobiaceae， 4.96%）、Norank Acidobacteria Gp3（4.89%）、Unclassified Rhodospirillales（3.22%）、Roseiarcaceae（3.14%）。

從屬分類水平來(lái)看（圖2e），相對(duì)豐度大于1%的共有21個(gè)，占比72.99%，其中相對(duì)豐度較大的8個(gè)屬依次為Unclassified Rhizobiales（11.67%） 、Gp2（8.96%）、Unclassified Planctomyc-etaceae（6.67%）、Gp1（6.61%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，4.96%）、Gp3（3.28%）.Unclassi-fied Rhodospirillales（3.22%）、Roseiarcus（3.14%）。

2.5根際土壤細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)

使用FAPROTAX對(duì)大王杜鵑根際土壤細(xì)菌群落功能注釋后共獲得24個(gè)功能種群分組，其中，相對(duì)豐度大于0.1%的有13個(gè)，占總豐度的20.28%；其他（Other）功能種群相對(duì)豐度小于0.1%，占總豐度的79.720/00 13個(gè)相對(duì)豐度大于0.1%的功能種群中，化能異養(yǎng)（Chemoheterotro-phy）、需氧化能異養(yǎng)（Aerobic chemoheterotrophy）和固氮作用（Nitrogen fixation）種群的相對(duì)豐度最大，均大于1%；其余10個(gè)功能種群的相對(duì)豐度均小于1%，依次為細(xì)胞內(nèi)寄生物（Intracellular para-sites）、發(fā)酵作用（Fermentation）、硝酸鹽還原（Ni-trate reduction）、尿素分解（Ureolysis）、硝化作用（Nitrification）、需氧亞硝酸鹽氧化（Aerobic nitrite oxidation）、動(dòng)物寄生或共生體（Animal parasites or symbionts）、人類病原體（Human pathogens all）、芳香族化合物降解（Aromatic compound degrada-tion）、葉綠體固氮（Chloroplasts，圖3）。

3討論與結(jié)論

土壤微生物是影響生態(tài)系統(tǒng)的重要因子，細(xì)菌作為土壤微生物中的主要菌種，其群落結(jié)構(gòu)特征是土壤微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生變化的敏感響應(yīng)，也是衡量土壤質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的關(guān)鍵因素，對(duì)植物的致瀕機(jī)制和保護(hù)有著重要意義。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)珍稀野生大王杜鵑根際土壤細(xì)菌群落進(jìn)行測(cè)序和分析，初步獲得大王杜鵑根際土壤細(xì)菌在門、綱、目、科、屬分類水平上的優(yōu)勢(shì)類群、功能種群分組及相對(duì)豐度。測(cè)序共獲得有效序列230 150條，基于≥97%的相似閾值對(duì)有效序列進(jìn)行聚類后獲得958個(gè)OTU，隸屬于19門54綱83目140科188屬，其中，優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（ Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacte-ria）、放線菌門（Actinobacteria）等6個(gè)門，變形菌門相對(duì)豐度最高，達(dá)38.47%，與殷根深等[22]對(duì)銹紅毛杜鵑（Rhododen，dron， bureavii）、乳黃杜鵑（R.lacteum）和亮鱗杜鵑（R.heliolepis）、方敏等對(duì)馬纓杜鵑（R.delavayi）、趙帆等對(duì)草莓（Fra-garia ananassa）、周強(qiáng)等對(duì)雙蕊蘭（Dipland-rorchis sinica）的研究結(jié)果一致，但不同植物在門分類水平以下的優(yōu)勢(shì)菌群存在明顯差異，這充分體現(xiàn)了不同植物根際土壤細(xì)菌群落豐富的多樣性，既有相似的優(yōu)勢(shì)菌群，也有各自獨(dú)特的菌群。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，大王杜鵑根際土壤細(xì)菌生態(tài)功能以化能異養(yǎng)、需氧化能異養(yǎng)和固氮作用為主，相對(duì)豐度分別為6.98%、6.65%和4.31%。已有研究表明，化能異養(yǎng)和需氧化能異養(yǎng)功能是廣泛的生態(tài)系統(tǒng)功能，更是與碳循環(huán)相關(guān)的重要生態(tài)功能，由變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Ac-idobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）等微生物參與執(zhí)行。變形菌門下有許多可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)和進(jìn)行固氮作用的促生根際菌，例如，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及種子萌發(fā)，慢生根瘤菌屬（Bradyrhi-zobium）和根微菌屬（Rhizomicrobium，）都具有固氮作用，伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）對(duì)植物生長(zhǎng)不僅具有促進(jìn)作用，還能抑制病害。本研究在大王杜鵑根際土壤細(xì)菌群落中檢測(cè)到的鞘氨醇單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、根微菌屬和伯克霍爾德菌屬的相對(duì)豐度分別為0.03%、4.96%、0.23%和0.08%，其中，慢生根瘤菌屬相對(duì)豐度較大，極有可能為大王杜鵑的生長(zhǎng)發(fā)育提供氮素營(yíng)養(yǎng)，其余3屬的相對(duì)豐度較小，是否具有上述生物學(xué)功能還需深入探究。此外，本研究在序列分析中發(fā)現(xiàn)存在部分未分類細(xì)菌（Unclassified Bacteria），這些菌種資源有待采用其它分析手段進(jìn)一步挖掘和研究。

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)珍稀野生大王杜鵑根際土壤細(xì)菌群落進(jìn)行測(cè)序和分析，從分子水平揭示了大王杜鵑細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，為今后開(kāi)展大王杜鵑根際促生菌的分離篩選、人工培育及瀕危機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。