張媛媛　鹿志偉　李茂富　姚全勝　侯曉婉

關鍵詞：菠蘿；黑心病，抗壞血酸過氧化物酶；qPCR；克隆

中圖分類號：S436.68 文獻標識碼：A

菠蘿[Ananas comosus （Linn.） Merr.]是鳳梨科鳳梨屬多年生單子葉常綠草本果樹，是世界三大熱帶水果之一，也是我國熱區(qū)的主要經(jīng)濟作物，主要集中在臺灣、廣東、廣西、福建、海南等省（區(qū)）。廣東省是我國菠蘿生產(chǎn)第一大省，其主栽品種為‘巴厘菠蘿，種植面積達35 639 hm²，產(chǎn)量達111.0 萬t[1-3]。然而‘巴厘菠蘿在采后貯藏和運輸期間極易發(fā)生黑心病（internal browning，IB），使果髓乃至果肉均變?yōu)楹诤稚瑢е鹿麑嵠焚|(zhì)顯著降低，耐儲能力大幅度縮減，給種植戶以及收果商帶來嚴重的損失[3]。

黑心病是由低溫（晝/夜<25 ℃/20 ℃）引起的生理失調(diào)癥，該病害發(fā)生的實質(zhì)是酶促氧化褐變[1， 4]。前人通過對不同園藝物種冷害生理反應的研究發(fā)現(xiàn)，長期低溫導致的液泡膜損傷、線粒體腫脹和內(nèi)部組織褐變[3， 5-6] ， 均會使活性氧（reactive oxygen species， ROS）含量增加。而ROS的過量積累誘導氧化損傷，對機體產(chǎn)生包括生物膜脂過氧化、DNA 損傷、蛋白質(zhì)變性等毒害效應[7]；對機體造成冷害的二次反應，使細胞膜結(jié)構(gòu)由相變成為剛變[5]。菠蘿由于田間或采后的長時間低溫冷害，使細胞膜出現(xiàn)不可逆的滲透性損傷，打破膜質(zhì)區(qū)域化劃分，導致質(zhì)體內(nèi)的多酚氧化酶（polyphenol oxidase， PPO）與液泡內(nèi)的酚類底物均釋放到細胞質(zhì)中，接觸氧形成化醌類物質(zhì)，引起果肉褐變[3， 8]。

為了維持自身ROS 的動態(tài)平衡，植物進化出一系列酶促和非酶促抗氧化防御系統(tǒng)[9]。非酶促抗氧化系統(tǒng)包括抗壞血酸（ascorbic acid， AsA）、還原型谷胱甘肽（lglutathione， GSH）等抗氧化物質(zhì)，而酶促抗氧化清除系統(tǒng)則包括抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase， GPX）等抗氧化蛋白酶[10-11] ， 其分別屬于水循環(huán)系統(tǒng)、AsA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)和GPX 循環(huán)系統(tǒng)， 其中AsA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)在抗氧化防御中發(fā)揮著主要作用[12]。本課題組前期用抗氧化劑AsA 處理采后‘巴厘菠蘿，發(fā)現(xiàn)AsA 能顯著減少機體內(nèi)H₂O₂含量、膜受損傷程度和PPO 活性，增強抗氧化防御系統(tǒng)關鍵抗氧化物酶活性，增加菠蘿的抗氧化能力，使ROS 毒害效應減弱，顯著降低菠蘿黑心病病情指數(shù)，延緩黑心病的發(fā)生[13-14]，但AsA 在其中的發(fā)生機制尚不明確。APX 作為AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的關鍵調(diào)節(jié)酶，以AsA 為電子供體，將H₂O₂轉(zhuǎn)換為H₂O，清除機體過量ROS，達到維持ROS 穩(wěn)態(tài)的目的[15]。前人研究發(fā)現(xiàn)APX 通過清除植物體內(nèi)的H₂O₂參與植物的多種發(fā)育生理過程和脅迫反應，如，ZHANG 等[16]研究表明，過表達OsAPX2 可以清除活性氧，提高水稻幼苗對干旱、鹽和低溫脅迫的耐受性；ZHANG 等[17]發(fā)現(xiàn)異源表達金孢隱霉菌CfAPX 降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥H₂O₂含量，具有較強的脅迫耐受性；CAVERZAN 等[18]研究表明chlAPXs 參與水稻光氧化脅迫下的光合作用和保護的調(diào)控作用。

本研究從菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫中（ https：//phytozome-next.jgi.doe.govinfo/Acomosus_v3）[19]篩選到6 個APX 基因，對黑心病發(fā)生過程以及抗壞血酸處理后的轉(zhuǎn)錄水平變化進行分析，發(fā)現(xiàn)抗壞血酸處理顯著增強AcAPX1 基因的表達，相關性分析發(fā)現(xiàn)， AsA 處理后菠蘿黑心病指數(shù)與AcAPX1 基因表達水平呈顯著正相關，因此，猜想AcAPX1 基因在AsA 延緩黑心病惡化中發(fā)揮重要作用。為探究其作用機制，進一步克隆AcAPX1基因，并對該基因進行氨基酸理化性質(zhì)、同源氨基酸比對、進化樹構(gòu)建、功能結(jié)構(gòu)域分析以及亞細胞定位等一系列生物信息學分析，為探究菠蘿AcAPX1 基因參與AsA 清除ROS，延緩黑心病惡化的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取菠蘿栽培品種‘巴厘（Ananas comosus L.cv. Comte de Paris）為試驗材料，樣本采收于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所菠蘿種植基地（21°10′2′′N， 110°16′34′′E）。抗壞血酸（AsA），純度99%，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 采后處理方法和RNA 提取 挑選無病蟲害、無機械損傷，果實大小一致的六成熟果60 個，用0.5 mg/L 咪鮮胺浸泡果實底部1 min，置陰涼通風處晾干備用。各取30 個果，分別用清水和0.2% AsA 水溶液浸泡果實底部15 min，待風干后，置于（25±2） ℃貯藏箱中，分別于貯藏0、3、6、9、12 d 時取F/C 處果肉，取樣方式、具體位置以及黑心病指數(shù)參考侯曉婉等[13-14]的方法，液氮冷凍后，研磨，用Quick RNA isolation Kit（北京華越洋生物技術(shù)有限公司）快速通用植物RNA提取試劑盒提取RNA，并選用TransStart? TopGreen qPCR SuperMix 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于–20 ℃冰箱備用。

1.2.2 菠蘿APX 基因轉(zhuǎn)錄水平分析 從菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫（ https：//phytozome-next.jgi.doe.govinfo/Acomosus_v3）[19]獲得菠蘿APX 基因序列，利用NCBI Primer designing tool （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/）進行定量引物設計（表1），通過全式金TransStart? Tip Green qPCRSuperMix 試劑盒進行熒光定量PCR 反應，其中，反應體系為20 μL，cDNA 模板1 μL，引物F（10 μmol/L）和R（10 μmol/L）均為0.4 μL，2×TransStart? Top Green qPCR SuperMix 10 μL，Prssive Reference Dye （50×） 0.4 μL，無菌去離子水7.8 μL。在Roche LightCycler^?96 熒光定量儀中進行擴增反應，反應程序如下：預變性95 ℃ 30 s，循環(huán)反應：變性94 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，40 個循環(huán)，溶解曲線：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。每個樣品設置3 個重復，相對表達量采用2?ΔΔCT法進行分析。

1.2.3 AcAPX1 基因的克隆 從菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫獲得菠蘿AcAPX1 蛋白序列及基因序列，運用Primer 5.0 軟件設計AcAPX1 基因編碼（codingsequence， CDS）全長序列克隆引物（表1）。使用TransStart? FastPfu DNA Polymerase 試劑盒對AcAPX1 基因CDS 全長序列進行擴增，PCR 擴增體系及反應條件如下：總體系50 μL，模板1 μL，引物F（10 μmol/L）和R（10 μmol/L）均為1 μL，5×TransStartd? FastPfu Buffer 10 μL ， NTP（2.5 mmol/L）4 μL，TransStart? FastPfu DNAPolymerase 1 μL， ddH2O 32 μL， 94 ℃ 預變性4 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，切膠回收純化，連接至T1 載體，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，并進行藍白斑篩選，挑選白色的陽性克隆菌斑后通過PCR 篩選分析，并送菌液進行測序。

1.2.4 AcAPX1 基因生物信息學分析 利用NCBI的ORF（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線軟件對AcAPX1 基因開放閱讀框進行分析；運用NCBI 在線搜索AcAPX1 在不同物種中的同源蛋白序列；通過Conserved domains 在線軟件（ https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對AcAPX1 蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域預測；通過ExPASy-ProtParam在線軟件（https：//web.expasy.org/ protparam/）對AcAPX1 蛋白的理化性質(zhì)進行分析；利用GSDS 2.0 在線軟件（http：//gsds.gaolab.org/）分析AcAPX1 基因結(jié)構(gòu)；使用DNAMANv.8.0 軟件對不同物種間的氨基酸序列進行比對；利用MEGA6 軟件進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建；利用在線軟件InterProScan （ https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）預測AcAPX1 蛋白的結(jié)構(gòu)特征；利用SOPMA 在線軟件（https：// npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html）預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL 在線軟件（ https：//www.swissmodel.expasy.org/）預測AcAPX1 蛋白三級結(jié)構(gòu)；通過在線軟件SignalP（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行蛋白的信號肽預測；使用在線分析軟件TMHMM v2.0（ http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）預測序列的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域；運用Cell-PLoc 2.0 在線預測軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc- 2/）對AcAPX1 蛋白進行亞細胞定位分析[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad prism 9.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和相關性分析，采用Excel 軟件制表[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA

提取菠蘿果肉（F/S）總RNA，經(jīng)電泳鑒定RNA 條帶完整（圖1），用核酸測定儀器測得其OD260/280 在1.6～1.8 之間，可用于反轉(zhuǎn)錄實驗。

2.2 菠蘿 APX 基因轉(zhuǎn)錄水平變化及其與黑心病指數(shù)的相關性前期研究發(fā)現(xiàn)AsA 延緩了黑心病的惡化，通過RT-qPCR 對采后貯藏0、3、6、9、12 d 的APX基因轉(zhuǎn)錄水平進行分析，結(jié)果顯示，6 個AcAPX基因均不同程度響應AsA 處理（圖2），表明APX以AsA 為電子供體，參與菠蘿的抗氧化過程，在延緩黑心病的惡化中發(fā)揮一定作用。在各個貯藏階段，AcAPX3、AcAPX5 基因在CK 和AsA 處理組中的表達整體變化趨勢一致，均持續(xù)下降，并且均在9 d 時，CK 與處理組有顯著差異；AcAPX2、AcAPX4 和AcAPX6 在貯藏初期顯著上調(diào)，3 d 后其表達呈下降趨勢；此外，處理組與CK間AcAPX2和AcAPX6 無顯著差異；而AsA 處理后AcAPX4在3 d 時極顯著下降，下降時間點從CK 組的6 d提前到3 d，表明AsA 處理提前了AcAPX4 對黑心病的響應時間。AcAPX1 在AsA 處理組和CK中的表達趨勢呈顯著差異，AsA 處理后AcAPX1基因呈持續(xù)上升的表達趨勢；而CK 中在貯藏初期上調(diào)后，隨著貯藏時間的延長，其表達量無顯著差異。

為了進一步篩選顯著響應AsA 延緩黑心病發(fā)生的關鍵基因，進行黑心病指數(shù)與AcAPXs 基因表達量的相關性分析（表2），結(jié)果表明，CK 中，AcAPX5 基因?qū)Σぬ}黑心病指數(shù)的影響最大，相關系數(shù)為–0.9348，呈顯著負相關（P<0.05），而與其他基因無顯著相關。AsA 處理組中，AcAPX1、AcAPX5 和AcAPX6 基因?qū)Σぬ}黑心病指數(shù)的影響較大，其相關系數(shù)分別為0.9362、–0.9142 和–0.8998，其中，與AcAPX5 和AcAPX6 基因呈顯著負相關（P<0.05），與AcAPX1 基因呈顯著正相關（P<0.05），與AcAPX1 基因的相關系數(shù)更接近1，說明與黑心病指數(shù)的相關性更大；并且貯藏后期AcAPX1 基因的表達極顯著高于CK。綜上表明，AcAPX1 基因顯著響應AsA 處理，可能在AsA 延緩黑心病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

2.3 菠蘿AcAPX1 基因的克隆及編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

以未處理的‘巴厘菠蘿果肉的cDNA 為模板，使用AcAPX1-F、AcAPX1-R 特異性引物，運用RT-PCR 擴增AcAPX1 基因的CDS 全長（圖3）。通過BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，擴增片段包含完整的CDS 序列，全長為753 bp，編碼250 個氨基酸殘基（圖4）。AcAPX1 編碼的蛋白分子量大小為27.410 87 kDa，分子式為C1220H1880N338O367S8，理論等電點為5.52，該蛋白有36 個帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu），28 個帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys），蛋白質(zhì)半衰期為30 h。菠蘿AcAPX1基因編碼的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為39.87（<40），表明該蛋白為穩(wěn)定蛋白；平均親水性常數(shù)為-0.436，說明該蛋白為親水性蛋白，脂溶指數(shù)為72.68，其氨基酸組成如表3 所示。運用GSDS 2.0 分析AcAPX1 基因結(jié)構(gòu)表明，該基因含有5′UTR 和3′UTR，9 個外顯子和8 個內(nèi)含子（圖5）。

2.4 菠蘿AcAPX1 蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析及同源氨基酸序列比對

利用NCBI Conserved Domain Search 尋找AcAPX1 蛋白的保守區(qū)，發(fā)現(xiàn)其含有APX 蛋白家族的保守序列，表明該蛋白屬于植物過氧化物酶（POD）超家族，并且具有血紅素結(jié)合位點、K+結(jié)合位點及底物結(jié)合位點（圖6）。通過NCBI 的Blast 工具對AcAPX1 氨基酸序列進行比對，結(jié)果表明，菠蘿AcAPX1 與番木瓜、香蕉、椰子、油棕等熱帶植物的序列相似性達85%以上（圖7）。結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域分析可得，AcAPX1 基因編碼的蛋白除了含有植物POD 結(jié)構(gòu)域，還含有XANX、LPDAX 等保守片段（圖7 紅色方框區(qū)域），這些片段是APX 與底物AsA 結(jié)合的關鍵。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用Construct/Test Neighbor-Jouning Tree，Bootstrap 值為1000，利用MEGA6 和Clustalx 軟件構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹，進化樹整體分為三大類（圖8），結(jié)果表明，菠蘿AcAPX1 與油棕EgAPX、椰子CnAPX 和海棗PdAPX 分為一組，表明菠蘿與熱帶植物的親緣關系較近。

2.6 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、信號肽預測和跨膜結(jié)構(gòu)域分析

通過SOPMA 在線軟件預測AcAPX1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，α-螺旋有103 個，占比為41.20%，無規(guī)則卷曲有93 個，占比為37.20%，延伸鏈有32 個，占比為12.80%，β-轉(zhuǎn)角有22 個，占比為8.8%（圖9A）。用SWISS-MODEL 在線軟件預測其蛋白三級結(jié)構(gòu)（圖9B）。利用TMHMMServer v.2.0 和SignalIP4.1Server 在線軟件分別檢測AcAPX1 蛋白質(zhì)的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，分析表明其蛋白無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域（圖9C），也無信號肽（圖9D）。

2.7 亞細胞結(jié)構(gòu)

通過Cell-PLoc 2.0 在線預測軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對AcAPX1蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白可能存在于細胞質(zhì)中。結(jié)合該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，加大了其定位在細胞質(zhì)的可能性。

3 討論

近年來，APX 基因的功能在水稻、擬南芥和玉米等植物中被廣泛報道，APX 基因具有響應各種非生物脅迫，增強植株抗氧化能力的功能。擬南芥、水稻缺乏APX 基因時，會造成H₂O₂含量升高，引起ROS 的過量積累，對機體造成氧化損傷，對生物大分子產(chǎn)生毒害效應，甚至導致細胞死亡[7]，降低植株抵御脅迫的能力[22-24]；過表達APX增強了水稻、擬南芥等植物的APX 酶活性，具有高效的ROS 清除性，提高了植株對干旱[15-16]、低溫[16]、重金屬[23]和鹽[25]等脅迫的耐受性。

菠蘿黑心病是一種長時間低溫冷害導致的生理失調(diào)癥。長期低溫冷害造成機體產(chǎn)生過量的ROS，引起膜損傷，使得質(zhì)體內(nèi)的PPO 與液泡內(nèi)的酚類底物接觸氧化形成醌類物質(zhì)。通過RTq-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，AcAPX1-6 基因均響應黑心病的發(fā)生。AsA 處理延緩黑心病的惡化后，改變了AcAPX1-6 基因的表達。特別是AcAPX1 基因，在AsA 處理后，其表達顯著上調(diào)，并且黑心病指數(shù)與AcAPX1 基因表達水平呈顯著正相關。AsA處理后，可能通過上調(diào)AcAPX1 的表達來延緩黑心病的發(fā)生?；赗Tq-PCR 和相關性分析結(jié)果，從‘巴厘菠蘿中成功克隆到AcAPX1 基因，分析表明該基因編碼的蛋白質(zhì)與其他物種APX 蛋白具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，具有AsA 結(jié)合位點、血紅素結(jié)合位點、K+結(jié)合位點，屬于POD 超家族，在清除ROS 和植物抵抗外界脅迫中發(fā)揮重要作用；系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，菠蘿AcAPX1 與油棕、椰子等熱帶植物的親緣關系較近；AcAPX1 蛋白為親水性蛋白，并且不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，亞細胞定位預測其定位于細胞質(zhì)中。

本研究結(jié)果為探究菠蘿AcAPX1 基因的功能及抗氧化機理奠定了基礎。下一步將構(gòu)建過表達載體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進一步研究該基因在抗氧化方面中的具體作用，解析AcAPX1 基因在AsA延緩菠蘿黑心病惡化中發(fā)揮的作用機制。