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        ‘海大2號’菠蘿蜜莖尖組培褐變過程中酚類物質及相關酶活性的影響

        2023-05-30 17:57:36丁燕郭佳慧范紫云向星星干雨露閔天雨楊廷豐鋒葉春海
        熱帶作物學報 2023年3期

        丁燕 郭佳慧 范紫云 向星星 干雨露 閔天雨 楊廷 豐鋒 葉春海

        關鍵詞:菠蘿蜜;組織培養(yǎng);褐化;抗褐化劑

        中圖分類號:S667.8 文獻標識碼:A

        菠蘿蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.),屬于??颇静ぬ}屬的熱帶果樹,常綠喬木,是一種集食用、藥用、木本糧食于一身的多用途經濟樹種[1],因果實甜美而受到歡迎,市場前景廣闊。大量研究表明,菠蘿蜜的葉、莖、種子和果肉具有較高的藥用、食用價值[2]。

        目前,菠蘿蜜的繁殖方式主要有實生繁殖、嫁接繁殖和組織培養(yǎng)[3]。由于實生繁殖后代易發(fā)生性狀分離而難以保存木本優(yōu)良性狀等問題,導致果實品味和品質發(fā)生較大改變[4]。目前生產上主要采取嫁接繁殖的方法,此方法可以保存母本優(yōu)良性狀。但因菠蘿蜜存在流膠較多的特性,嫁接時創(chuàng)面極易被膠污染,成活率受到嚴重影響[5]。

        組織培養(yǎng)可加快植物的繁殖速度,在短期內獲得大量遺傳性一致的種苗,并使其保持母本優(yōu)良的性狀,更有利于新品種的選育[10],目前在香蕉、桉樹、蝴蝶蘭等植物上得到廣泛應用。前人曾利用菠蘿蜜嫩莖等外植體通過組織培養(yǎng)獲得試管苗[7-9]。但利用成年菠蘿蜜樹莖尖來進行繁殖尚無報道。1960年,MOREL[10]就利用大花穗蘭的莖尖成功誘導分化出植株。利用此技術于‘海大2 號組培快繁中發(fā)現(xiàn),菠蘿蜜組織培養(yǎng)過程中褐化嚴重,導致其難以建立無性繁殖體系,產業(yè)化生產難以實現(xiàn)。

        周亞輝等[11]研究認為,組培褐化機制可分為酶促褐變和非酶促褐變2 種,菠蘿蜜外植體的褐變主要是酶促褐變,在氧化酶催化下酚類物質形成褐色的醌類及其聚合物稱為酶促褐變。牛佳佳等[12]研究認為,醌類化合物的產生會使得外植體的傷口處變深褐色,這些褐色物質產生后會慢慢滲透到培養(yǎng)基中,來達到抑制其他酶活性產生這一目的,植株在吸收營養(yǎng)物質時受到阻止,導致外植體褐變而死亡,植株的生長受到影響。

        菠蘿蜜組織培養(yǎng)快繁全過程的理論和技術已基本成熟,然而在實際生產上卻難于重復和推廣[13]。為盡早實現(xiàn)菠蘿蜜的工廠化繁殖,為獲得大量優(yōu)質苗木而奠定基礎,本研究以菠蘿蜜莖尖為材料,探究經過不同低溫(4 ℃)處理后及不同濃度PVP 對外植體褐化的影響,并測定各處理下莖尖PPO 活性、酚類物質含量,以此更深入地了解菠蘿蜜組織培養(yǎng)褐化的因素,探究褐化的機理。旨在促進菠蘿蜜組培快繁技術體系的建立,以期為構建菠蘿蜜種苗繁育技術體系及其產業(yè)化生產示范提供理論依據。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        本研究試驗材料‘海大2 號菠蘿蜜外植體來自廣東海洋大學后山園林基地,選取長勢強壯,無病蟲害的植株,在晴天早晨進行采摘。實驗培養(yǎng)基采用1/2 MS 培養(yǎng)基,NAA 0.1 mg/L,蔗糖30 g/L,瓊脂5.5~6.0 g/L,pH 5.8,培養(yǎng)溫度(24±1) ℃,光照強度2000 Lx,光照10 h/d。實驗中所用藥劑均來自麥克林公司及廣州試劑廠。

        經過表面滅菌處理后,將外植體依次接種至滅菌培養(yǎng)基中,每個處理接種30 瓶,每瓶接種1個頂芽,3 次重復。15 d 后統(tǒng)計菠蘿蜜外植體的污染率和褐化率。低溫(4 ℃)處理時間分別設定為12、24、48 h,15 d 后分別統(tǒng)計其褐化率及萌芽率,并測定其PPO 活性及酚類物質含量[6, 14]。

        外植體經過12~24 h 的低溫處理后將接入不同濃度的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)培養(yǎng)基中,15 d后分別統(tǒng)計其褐化率及萌芽率,并測定其PPO 活性及酚類物質含量。

        1.2 方法

        外植體底部褐色色塊超過0.1~0.5 cm 均為褐化(圖1)。采用以下誘導評價公式計算萌芽率及褐化率。

        萌芽率=誘導出腋芽的瓶數/同批次接種的外植體瓶數×100%

        褐化率=褐化的外植體數/同批次接種的外植體瓶數×100%

        1.3 數據處理

        試驗數據采用Microsoft Excel 2007 軟件對重復樣的平均值與標準差進行計算,采用DPS 7.05軟件和Duncans 分析法對不同指標進行差異顯著性分析。

        2 結果與分析

        2.1 不同低溫預處理時間對菠蘿蜜莖尖組培褐化的影響

        如表1 所示,未進行低溫處理的外植體,褐化率高達58.89%,萌芽率為38.89%。隨著低溫處理時間的延長,其褐化率顯著降低。低溫處理12 h,外植體的褐化率為46.67%,與其他處理相比,差異顯著。低溫處理24 h,萌芽率最高,達到57.78%,與對照組相比,差異顯著。結果表明,采集后的菠蘿蜜外植體經過一定的低溫預處理后,對其褐化率及萌芽率影響顯著(圖2)。

        2.2 不同PVP濃度對菠蘿蜜莖尖組培褐化的影響

        如表2 所示,PVP 的添加對菠蘿蜜外植體褐化及萌芽率的影響顯著。PVP 濃度為2.0 g/L 時,褐化率最低,萌芽率最高,分別為15.56%和66.67%,與對照組相比,褐化率降低了41.11%,萌芽率升高了30.00%,差異顯著。結果表明,PVP對菠蘿蜜外植體的褐化能夠起到抑制作用,且在濃度為2.0 g/L 時,效果最佳。具體生長情況見圖3,驗證效果見圖4。

        2.3 不同低溫預處理時間對‘海大2 號菠蘿蜜莖尖PPO 活性、總酚及總黃酮含量的影響

        2.3.1 PPO 活性 如圖5A 所示,‘海大2 號菠蘿蜜莖尖在經過低溫處理后,體內PPO 的活性并未出現(xiàn)下降的趨勢,各處理組均高于對照,且隨著低溫處理時間的延長,體內PPO 活性隨之增加,在低溫處理48 h 時,PPO 活性達到最高值,為229.07 U/(gmin),且各處理與對照組相比,差異顯著。

        2.3.2 總酚含量 如圖5B 所示,‘海大2 號菠蘿蜜莖尖在經過低溫處理后,與對照組相比,呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。低溫處理12 h 和24 h,其體內的總酚含量與對照組相比有下降的趨勢,且在低溫處理12 h 時達到最低值,為35.47 mg/g,與對照組相比下降了13.56%。在低溫處理48 h后,莖尖的總酚含量高于對照組。

        2.3.3 總黃酮含量 如圖5C 所示,菠蘿蜜莖尖在經過低溫處理后,外植體體內黃酮的含量均呈現(xiàn)不同程度的降低,與對照組相比差異顯著。在低溫處理24 h 后,菠蘿蜜外植體體內的總黃酮含量最低,為40.04 mg/g,與對照組相比下降37.25 mg/g。低溫處理12 h 和48 h 后,外植體總黃酮含量與對照組相比分別降低21.62%和8.72%。

        2.4 不同PVP 濃度對‘海大2 號菠蘿蜜莖尖PPO 活性、總酚及總黃酮含量的影響

        2.4.1 PPO 活性 如圖6A 所示,培養(yǎng)基中添加PVP 后,菠蘿蜜外植體內PPO 活性與對照組相比,差異顯著,當添加濃度為2.0 g/L 時,PPO 活性最低,為82.67 U/(gmin),與對照組相比降低了318.66 U/(gmin)。其他處理組與對照組相比,PPO活性均有不同程度的降低,且與對照組相比分別降低了185.06、70.66 U/(gmin)。

        2.4.2 總酚含量 如圖6B 所示,當添加濃度為1.0 g/L 時,總酚含量與對照組相比無明顯差異。添加的PVP 濃度為2.0 g/L 時,菠蘿蜜莖尖總酚含量最低,為28.46 mg/g,與對照組相比降低了25.90 mg/g,差異顯著。添加的PVP 濃度為3.0 g/L時,與對照組相比總酚含量下降了11.79 mg/g。

        2.4.3 總黃酮含量 如圖6C 所示,PVP 添加后,外植體的總黃酮含量顯著降低。PVP 濃度為1.0 g/L時,外植體的總黃酮含量與對照組相比降低了19.21 mg/g。PVP 濃度為2.0 g/L 時,菠蘿蜜外植體總黃酮含量達到最低值,為17.21 mg/g。PVP 濃度為3.0 g/L 時,外植體的總黃酮含量與對照組相比降低了33.06 mg/g。各處理組與對照組相比,差異顯著。

        3 討論與結論

        3.1 討論

        菠蘿蜜莖尖組織培養(yǎng)中,經過低溫處理后能夠有效地降低褐化。前人研究發(fā)現(xiàn),外植體在高溫培養(yǎng)下,褐變加劇,而降低培養(yǎng)溫度后發(fā)現(xiàn),褐化得到明顯的改善,這與本試驗研究結果一致[15-16]。喻娜[17]研究認為,低溫組培下的外植體有利于降低褐化,劉蘭英[15]在核桃組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),低溫下進行組織培養(yǎng)可降低褐化,羅麗華[16]在板栗愈傷組織培養(yǎng)中研究發(fā)現(xiàn),低溫處理可減輕外植體褐化的現(xiàn)象。在本研究中,菠蘿蜜外植體進行一定時間的低溫預處理后,與對照組相比,外植體體內的總酚及總黃酮含量顯著降低,試驗結果與前人研究結果一致,即適當的低溫處理有利于外植體褐化率的降低。

        PVP 添加后,發(fā)現(xiàn)不同濃度的PVP 均能降低外植體的褐化,這與劉英[18]研究結果一致。目前普遍認為,外植體的褐化與多酚氧化酶(PPO)對酚的作用有關,乜蘭春等[19]研究認為PPO 是酚類催化反應的關鍵酶,因為酚會氧化形成醌[20],醌會導致外植體的褐化,目前很多學者認為這是導致褐化的主要原因,但不是唯一的原因,眾多學者一直就這方面進行研究與探討,但目前還未得到一致結論。酚酸、類黃酮和單寧是酚類物質結構的三大類化合物,這三大類化合物在褐變過程中充當著重要的角色[21]。印芳[22]研究認為,蝴蝶蘭的褐化與酚酸類物質有關,劉紅[23]研究結果表明,各處理下的外植體總酚含量與褐化程度呈正相關,即褐化越重,總酚含量越高,本研究也得到了同樣結果。

        前人研究表明,辣椒和葡萄的褐化可用硝酸銀緩解[24-25],焦金鳳[26]認為,合適的抗褐化劑物質有利于降低植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的褐化問題,植物組培養(yǎng)中常用的抗褐化劑根據其作用機理可分為兩大類型:(1)防止酚氧化的抗氧化劑,如,VC、Na2S2O3、CA 等;(2)用來吸附醌類物質的吸附劑,如AC、PVP 等。本研究結果表明,添加PVP 2.0 g/L 時用菠蘿蜜組織培養(yǎng)抗褐化的效果最好,這可能是因為同一種褐化劑的不同濃度起到的抗褐化效果不一樣[26],張俊林等[27]在核桃組培中,JAIN 等[28]在歐洲李組織培養(yǎng)中研究發(fā)現(xiàn),抑制植物組培褐化效果最好的抗褐化劑是PVP,本試驗在添加2.0 g/L PVP 時,對抑制菠蘿蜜莖尖褐化起到了較好的效果。張小紅等[29]在對核桃進行組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),Na2S2O3抑制植物組培褐化效果最好。劉霞等[30]研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中添加AC 對烏龍子根芽眼組織培養(yǎng)的效果最好,由此可見,不同植物的外植體、取材時間、部位等均會影響抗褐化劑的效果[26]。本研究結果表明,酚類物質的含量與褐變程度呈正比,這與許傳俊等[31]在蝴蝶蘭的研究中、毛沛琪[6]在牡丹等的研究中結果一致。此外,前人研究表明,降低酚類物質即可降低褐化[32-33],本研究結果也反映出了這一現(xiàn)象。

        3.2 結論

        本研究以‘ 海大2 號菠蘿蜜莖尖為試驗材料,分析了低溫預處理后菠蘿蜜的莖尖及不同濃度PVP 對菠蘿蜜莖尖PPO 活性、總酚及總黃酮含量的影響,研究結果表明:在低溫處理12 h,菠蘿蜜外植體總酚含量最低,低溫處理24 h,外植體總黃酮含量最低。莖尖經過12~24 h 低溫處理后再接入添加2.0 g/L PVP 的1/2 MS 培養(yǎng)基中,這一濃度下菠蘿蜜外植體的褐化率最低且萌芽率最高,且驗證結果表明,此方法有利于菠蘿蜜莖尖的增殖。

        本試驗對菠蘿蜜外植體組培過程中褐化的抑制進行了研究,初步探索了菠蘿蜜外植體在組培過程中影響褐化的一些外部因素,且對部分影響較大的因素如總酚、總黃酮及多酚氧化酶進行了指標的測定,菠蘿蜜褐變的研究是一項長期而又艱巨的任務,菠蘿蜜組織培養(yǎng)技術還不夠成熟,其增殖及生根體系等有待進一步研究,希望今后可以進行深入的研究,加大對醌類物質的鑒定分析。

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