崔瑋琪 馮曉 宋瑞強(qiáng) 楊勛 楊雙 蘇兆軍

摘 要：為全面、系統(tǒng)地了解濱州市地區(qū)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）苗種攜帶蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）及爆發(fā)情況，對(duì)濱州地區(qū)37家凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘隨機(jī)采集對(duì)蝦苗種樣本，根據(jù)SC/T 7232-2020 《蝦肝腸胞蟲病診斷規(guī)程》采用套式PCR法進(jìn)行對(duì)蝦苗種蝦肝腸胞蟲的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明濱州地區(qū)蝦肝腸胞蟲陽性檢測(cè)率為4.84%，同時(shí)監(jiān)測(cè)蝦肝腸胞蟲病發(fā)病池和未發(fā)病池的水質(zhì)，發(fā)現(xiàn)發(fā)病池的水體中pH值、COD等指標(biāo)并沒有顯著差異，說明蝦肝腸胞蟲病爆發(fā)并不是由于養(yǎng)殖池水質(zhì)導(dǎo)致的。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）；蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）；PCR；檢出率

近年來由于對(duì)蝦疫病的頻繁爆發(fā)，使得對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)受到了較大的沖擊。其中有一種常見的疾病在泰國、印度、越南和中國等國家中流行，可造成對(duì)蝦苗種生長極其緩慢或停止［1］，其病原微生物為蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。

EHP的流行率較高，已經(jīng)成為威脅我國養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)嚴(yán)重病原。我國于2013年在浙江臺(tái)州養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺中首次檢出EHP，此后在我國沿海地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大量EHP感染病例。2015年遼寧營口的對(duì)蝦EHP檢出率為34.6%［2］；粵西地區(qū)養(yǎng)殖對(duì)蝦EHP檢出率為41.38%［3］；浙江舟山養(yǎng)殖對(duì)蝦EHP檢出率為85.19%［4］，檢出率逐年上升。本文就濱州地區(qū)EHP的發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查分析，以期為建立有效防控技術(shù)方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

調(diào)查區(qū)域包括濱州市沾化區(qū)、無棣縣、博興縣凡納濱對(duì)蝦工廠化養(yǎng)殖池，隨機(jī)抽取37家苗種養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行抽檢（選取苗種日期相近的養(yǎng)殖場(chǎng)）。此次調(diào)查從3月開始到7月結(jié)束，每七天為一個(gè)周期進(jìn)行取樣檢測(cè)，共計(jì)得到樣品195份。

1.2 樣品EHP檢測(cè)

1.2.1 樣品前處理 取凡納濱對(duì)蝦蝦苗全蝦在已滅菌的研缽中研磨，將研磨后的組織放在無菌的離心管中，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 總DNA的提取 取研磨好的樣品約20 mg左右，采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 DNA提取試劑盒進(jìn)行對(duì)蝦樣品總DNA的提取，提取后采用-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 檢測(cè) 根據(jù)SC/T 7232-2020《蝦肝腸胞蟲病診斷規(guī)程》采用套式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，套式PCR擴(kuò)增體系所需引物序列見表1，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，最后4 ℃保溫。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)后， 送至生工生物工程（濟(jì)南） 股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行進(jìn)一步的基因序列對(duì)比，進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

將兩輪陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中EHP的致病基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增出的陽性片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中的EHP致病基因的序列相似度為98%。部分對(duì)蝦樣品的電泳圖見圖1和圖2。

3 討論

3.1 濱州地區(qū)EHP感染情況

本研究對(duì)2022年3—7月期間濱州地區(qū)的凡納濱對(duì)蝦苗種養(yǎng)蝦池EHP的感染情況進(jìn)行了調(diào)查與分析，結(jié)果表明，EHP的發(fā)病率在4.84%，主要集中在4—5月。通過對(duì)發(fā)病池和未發(fā)病池的水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其pH值、COD等指標(biāo)并沒有顯著差異。

3.2 病因分析

蝦肝腸胞蟲?。‥nterocytozoon hepatopenaei disease）也稱作肝胰腺微孢子蟲?。℉epatopancreatic microsporidiosis， HPM），最早是在馬來西亞養(yǎng)殖斑節(jié)對(duì)蝦的肝胰腺中發(fā)現(xiàn)的［5-6］，2004年研究人員發(fā)現(xiàn)泰國養(yǎng)殖斑節(jié)對(duì)蝦體中也存在微孢子感染，Tourtip等 （2009）將這類感染對(duì)蝦肝胰腺的微孢子蟲正式命名蝦肝腸胞蟲，此后在越南、印度、中國、委內(nèi)瑞拉等國家?guī)缀跬瑫r(shí)檢測(cè)出EHP，目前EHP已經(jīng)成為危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要病原之一。

蝦肝腸胞蟲在分類上屬微孢子綱（Microsporea），腸胞蟲科 （Enterocytozoonidae） ，腸胞蟲屬（Enterocytozoon）［7］，是一種可感染多種真核生物的專型細(xì)胞內(nèi)寄生真菌。成熟的蝦肝腸胞蟲的孢子呈橢圓形，具有極絲、1個(gè)細(xì)胞核和1 個(gè)后位空泡，由幾丁質(zhì)構(gòu)成的孢包裹，大小為（1.1±0.2）μm×（0.7±0.1）μm［8］?；疾?duì)蝦肝胰腺和腸道顏色較深，嚴(yán)重者肝胰腺萎縮，生長緩慢，個(gè)體明顯偏小，感染群體生長差異明顯增大。正常養(yǎng)殖條件下，攝食正常，腸胃充滿食物，不出現(xiàn)大量、急性死亡。體長相同時(shí)，發(fā)病群里的平均體重約為EHP陰性的70%。

濱州地區(qū)EHP發(fā)病率為4.84%，相對(duì)較低，造成原因有兩個(gè)方面，一是EHP的傳播有兩種形式：一種是垂直傳播，即通過親蝦傳播給子代；另一種是水平傳播，即攝食寄生EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或環(huán)境中的孢子體而感染［9-10］。通過對(duì)發(fā)病池和未發(fā)病池水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)兩者差異不顯著，可能是由于采集的樣品為蝦苗，尚未攝食鮮活餌料，因此未發(fā)生水平傳播，沒有造成大范圍的傳染。二是由于2020年起，為從源頭嚴(yán)格控制重大水生疫病的傳播，山東省開始實(shí)行水產(chǎn)苗種產(chǎn)地檢疫工作，加大對(duì)出廠苗種的管控力度，提高了水產(chǎn)苗種質(zhì)量，降低了疫病發(fā)生率。

3.3 防控措施

苗種作為最重要的投入品，處于養(yǎng)殖生產(chǎn)中的首要環(huán)節(jié)，實(shí)施苗種檢疫可以從源頭切斷疫病的傳播途徑，因此養(yǎng)殖企業(yè)購買苗種時(shí)應(yīng)購買具有資質(zhì)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)合格的苗種。

水質(zhì)是對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中第二個(gè)重要環(huán)節(jié)。水質(zhì)管理的好壞，直接決定著對(duì)蝦養(yǎng)殖的成敗，因此養(yǎng)殖池中的水要進(jìn)行徹底消毒后方可使用，且要時(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖水的指標(biāo)。

出現(xiàn)對(duì)蝦生長緩慢現(xiàn)象的養(yǎng)殖池要進(jìn)行徹底的清塘和消毒，防止病毒繼續(xù)傳播。

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（收稿日期：2023-02-15；修回日期：2023-02-24）