潘林 彌春霞 徐青山 魏倩倩,3 孔亞麗朱練峰 田文昊 金千瑜 張均華* 朱春權(quán)*

（1 牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2 中國水稻研究所/水稻生物育種全國重點實驗室，杭州 310006；3 安徽大學(xué)，合肥 230601；#共同第一作者；*通迅作者：zhangjunhua@caas.cn；zhuchunquan@caas.cn）

磷是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素，不僅是細胞膜和三磷酸腺苷（ATP）的主要組成成分，也參與植物光合作用等生理生化反應(yīng)[1]。磷在土壤中易通過化學(xué)固定、吸附和生物固定等作用形成不能被植物直接吸收利用的難溶態(tài)磷，從而對作物造成缺磷脅迫。據(jù)統(tǒng)計，我國約2/3 面積的耕地處于缺磷狀態(tài)[2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)通過施加磷肥保障作物對磷的吸收。然而，作物對磷的當季利用率很少超過25%[3]。目前，我國耕地土壤中的總磷含量為0.2～1.1 g/kg，將土壤中這部分固定態(tài)磷釋放出來供作物利用，是提高磷利用效率和促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)綠色可持續(xù)發(fā)展的重要研究方向。

土壤中存在具有解磷能力的細菌，統(tǒng)稱為解磷細菌，其可通過自身代謝產(chǎn)物或其他作用將土壤中固定的磷轉(zhuǎn)化成可被植物直接吸收的有效磷，從而提高植物對磷的利用率，促進植物生長發(fā)育[4]。目前，解磷細菌的解磷機制主要包括：降低土壤pH 值促進土壤中難溶態(tài)磷的釋放，比如通過呼吸作用產(chǎn)生CO2，對生物殘渣分解產(chǎn)生酸性物質(zhì)，與NH4+發(fā)生同化反應(yīng)產(chǎn)生質(zhì)子，合成和釋放硫化氫及釋放有機酸等途徑降低土壤pH值[5-9]；通過分泌磷酸酶、植酸酶、核酸酶和脫氫酶等胞外酶類物質(zhì)降解土壤中的有機磷[10]。

作者從水稻根際土壤中篩選得到2 株解磷細菌，鑒定為阿氏芽孢桿菌（Priestia aryabhattai）和甲殼蟲WSH-0021 細菌（Bacillus megaterium WSH-0021）。我們將篩選得到的解磷細菌分別接種至2 種不同磷含量的土壤進行培養(yǎng)，30 d 后通過測定土壤微生物量磷、細菌豐度、有效磷含量、磷酸酶活性和pH 值等，分析其解磷能力和解磷機制，為后期解磷細菌的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 目的菌株的篩選與鑒定

提取中國水稻研究所富陽基地大田中水稻根際土，用滅菌超純水對水稻根際土以土水比1∶10（質(zhì)量比）進行重懸，然后進行10 倍的梯度稀釋，將稀釋液分別涂布于解無機磷細菌和解有機磷固體篩選培養(yǎng)基。篩選獲得的細菌用LB 液體培養(yǎng)基進行擴繁，連續(xù)傳代3 次后，運用16s rRNA（27f 和1492r）進行菌液PCR，獲得的產(chǎn)物送至杭州有康生物科技有限公司進行測序，然后在NCBI 上進行比對，最終得到2 種細菌，分別為阿氏芽孢桿菌（從解有機磷細菌鑒定培養(yǎng)基上獲得）和甲殼蟲WSH-0021 細菌（從解無機磷細菌鑒定培養(yǎng)基上獲得）。

將鑒定得到的2 種解磷細菌分別加入解無機磷細菌和解有機磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以滅菌的解無機磷細菌和解有機磷液體培養(yǎng)基作為對照，培養(yǎng)條件為30 ℃和180 rpm，當菌液OD600 為0.5 時測定液體培養(yǎng)基中的有效磷含量，以不接菌的培養(yǎng)基作為對照。

解無機磷細菌篩選和鑒定培養(yǎng)基配方：葡萄糖10 g/L，硫酸銨0.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，氯化鉀0.3 g/L，氯化鈉0.3 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸錳0.03 g/L，硫酸鉀0.3 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，磷酸鈣5.0 g/L，pH 值7.0～7.5。根據(jù)需要添加15 g/L 瓊脂。解有機磷細菌篩選和鑒定培養(yǎng)基配方：葡萄糖10 g/L，硫酸銨0.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸錳0.03 g/L，硫酸鉀0.3 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，卵磷脂0.2 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，pH值7.0～7.5。根據(jù)需要添加15 g/L 瓊脂。肉湯培養(yǎng)基（LB）配方：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 值7.0～7.2。

1.2 土壤培養(yǎng)實驗

分別采集浙江省杭州市富陽區(qū)學(xué)院路茶園和中國水稻研究所水稻田0～20 cm 表層土壤（分別命名為土樣1 和土樣2），將土壤放入采集袋中，風(fēng)干過篩后備用。土樣1 和土樣2 的全磷含量分別為0.24 g/kg 和0.75 g/kg，有效磷含量分別為4.93 mg/kg 和14.92 mg/kg，pH 值分別為5.84 和6.27。

將篩選得到的2 種細菌分別在LB 液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，在30 ℃、180 rpm 條件下振蕩培養(yǎng)，待菌液OD600 為0.5 時取出菌液，以菌液∶土壤=12 mL∶100 g 的比例添加菌液，調(diào)節(jié)土壤絕對含水量為20%。對照土壤添加不接細菌的滅菌培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d 后，取土樣備用。每個樣品3 次重復(fù)。

1.3 菌株生長曲線繪制

將菌株接入LB 液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 rpm條件下進行震蕩培養(yǎng)，每隔1 h 取樣1 次，并測定菌液OD 值和pH 值，繪制生長曲線[11]。每個樣品3 次重復(fù)。

1.4 磷含量測定

土壤和液體培養(yǎng)基中的磷含量采用鉬銻抗比色法[12]測定。每個樣品重復(fù)3 次。

1.5 土壤細菌豐度測定

用土壤DNA 快速提取試劑盒（Fast DNA SPIN Kit for Soil）提取土壤微生物總DNA。用不同含有16s rRNA 片段的質(zhì)粒制作標曲。根據(jù)Ct 值和土壤干質(zhì)量計算土壤樣品中細菌的總拷貝數(shù)。采用16s rRNA-F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和16s rRNA-R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）進行實時熒光定量PCR。其中PCR 反應(yīng)體系為：DNA 模板2.5 μL，引物（10 μmol/L）各1.5 μL，Sybgreen 25 μL，dd H2O 19.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃3 min；94 ℃1 min，52 ℃1 min，72 ℃1.0 min，32 個循環(huán)；72 ℃10 min。

1.6 酸性磷酸酶活性測定

稱取5 g 土壤置于200 mL 三角瓶中，加入2.5 mL甲苯，輕搖15 min，加入20 mL 0.5%的磷酸二甲苯，搖床中37 ℃過夜培養(yǎng)，隨后加入100 mL 0.3%的硫酸鋁溶液并過濾。吸取3 mL 濾液，采用磷酸苯二那比色法測定酸性磷酸酶活性[13]。

1.7 土壤pH 測定

將風(fēng)干土壤按照水土比2.5:1 的比例混合，在25 ℃、180 rpm 條件下振蕩30 min，靜置后用pH 計測定pH[14]。

1.8 土壤微生物量磷含量測定

每個樣品稱取2 組土壤，1 組采用熏蒸法處理，1 組不熏蒸。將2 組樣品分別吸取25 mL 于150 mL 三角瓶中，加入1 mL 33%硫酸溶液，加入4 mL 15%過硫酸鉀溶液。放入高壓滅菌鍋，20 min 取出。采用鉬銻抗比色法測定土壤中磷含量[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷細菌篩選和鑒定

在解有機磷和解無機磷固體培養(yǎng)基分別篩選得到的細菌，運用16s rRNA 擴增后進行測序，將測得序列在NCBI 網(wǎng)頁中進行同源性比較，結(jié)果得出解有機磷細菌篩選得到的細菌與阿氏芽孢桿菌同源性為99%，解無機磷細菌培養(yǎng)基中篩選得到的細菌與甲殼蟲WSH-0021 細菌同源性為99%。

觀察2 種菌的菌落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)阿氏芽孢桿菌的菌落小，呈黃色，形狀不規(guī)則，菌落較透明，周圍稍突起，有溶磷圈（圖1 A）。甲殼蟲WSH-0021 菌落小，呈黃色，圓型，菌落不透明，較濕潤，周圍無突起（圖1 B）。

圖1 篩選得到的兩種解磷細菌的菌落形態(tài)

阿氏芽孢桿菌在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的前8 h 處于延緩期，8 h 后進入對數(shù)期，生長發(fā)育迅速，培養(yǎng)基的pH 值也迅速下降，從7.00 下降至6.45 左右；12 h 后細菌進入穩(wěn)定期（圖2 A）。甲殼蟲WSH-0021 細菌延緩期較長，在前12 h 處于延緩期，12 h 后進入對數(shù)期，培養(yǎng)基的pH 值也迅速下降，從7.00 下降至6.47；17 h 后細菌進入穩(wěn)定期（圖2 B）。

圖2 阿氏芽孢桿菌（A）和甲殼蟲WSH-0021 細菌（B）的生長曲線和pH 變化

2.2 解磷能力鑒定

將篩選得到的2 株細菌分別培養(yǎng)在有機磷和無機磷鑒定培養(yǎng)基中，24 h 后測定上清液中的有效磷含量。結(jié)果顯示，接種阿氏芽孢桿菌后，解有機磷鑒定培養(yǎng)基中的有效磷含量從3.05 mg/L 增加到了57.920 mg/L，增幅1 799.02%；接種甲殼蟲WSH-0021 細菌后，解無機磷鑒定培養(yǎng)基中的有效磷含量從204.28 mg/L 增加到了1 004.60 mg/L，增幅391.78%（表1）。

表1 2 種解磷細菌解磷能力鑒定

2.3 土壤中解磷能力鑒定

2 株細菌接種至不同磷含量的土樣后培養(yǎng)7 d，分別測定土壤細菌豐度。從表2 可見，接種阿氏芽孢桿菌和甲殼蟲WSH-0021 細菌后均顯著增加土壤的細菌豐度。土樣1 的細菌豐度從1.33 ×109copies/g DW 分別增加至7.61 ×109copies/g DW 和53.20 ×109copies/g DW，增幅分別為3 900.00%和148.99%；土樣2 的細菌豐度活性從38.99 ×109copies/g DW 分別增加至92.35×109copies/g DW 和97.08 ×109copies/g DW，增幅分別為136.86%和148.99%。

從表3 可見，接種阿氏芽孢桿菌和甲殼蟲WSH-0021 細菌后均顯著增加土壤的微生物量磷含量。土樣1的微生物量磷含量從1.89 mg/kg 分別增加至6.35 mg/kg和39.58 mg/kg，增幅分別為235.98%和1 994.18%；土樣2 的微生物量磷含量從2.70 mg/kg 分別增加至48.25 mg/kg 和3.17 mg/kg，增幅分別為1 687.03%和17.41%。

表3 土壤中微生物量磷測定結(jié)果

從表4 可見，接種阿氏芽孢桿菌顯著增加土樣1中的有效磷含量從4.68 mg/kg 增加至5.32 mg/kg，增幅13.68%。阿氏芽孢桿菌雖然增加了土樣2 中的有效磷含量，增幅為12.07%，但差異不顯著。接種甲殼蟲WSH-0021 細菌顯著增加土樣1 和土樣2 中的有效磷含量，分別從4.68 mg/kg 增加到5.67 mg/kg 和從12.92 mg/kg 增加到19.47 mg/kg，增幅分別為21.15%和11.66%。

2.4 土壤的pH 變化

從表5 可見，接種阿氏芽孢桿菌和甲殼蟲WSH-0021 細菌后均顯著降低土壤的pH 值，其中土樣1 的pH 值從5.84 分別降低至5.57 和5.67，土樣2 的pH 值從6.27 分別降低至5.86 和5.87。

表5 土壤pH 值變化

2.5 土壤中的酸性磷酸酶活性

從表6 可見，接種阿氏芽孢桿菌和甲殼蟲WSH-0021 細菌后均顯著增加土壤的酸性磷酸酶活性。土樣1 的酸性磷酸酶活性從0.26 mg/（kg·h）分別增加至0.62 mg/（kg·h）和0.45 mg/（kg·h），增幅分別為138.46%和73.07%；土樣2 的酸性磷酸酶活性從0.05 mg/（kg·h）分別增加至0.92 mg/（kg·h）和0.22 mg/（kg·h），增幅分別為1 760.00%和3 400.00%。

表6 土壤中酸性磷酸酶活性變化

3 結(jié)論與討論

解磷微生物包括解磷細菌、解磷真菌和解磷放線菌，其中以解磷細菌效果最好。朱德旋等[16]篩選出的伯克霍爾德菌屬高效解磷菌，在含磷酸三鈣的無有效磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d 后，其發(fā)酵液中可溶性磷含量高達832.74 mg/L，將菌接種至土壤后，不僅顯著提高水稻根際土中的有效磷含量，還顯著提高水稻的分蘗數(shù)、株高、根長和千粒重。接種菌株BS06 高效解磷菌顯著提高甘蔗莖、葉、根等器官中的總磷含量，同時提高甘蔗的株高和干質(zhì)量[17]。本實驗中篩選得到的阿氏芽孢桿菌和甲殼蟲WSH-0021 細菌，在不含有效磷的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，其液體培養(yǎng)基中的可溶性磷含量分別比對照增加了1 799.02%和391.78%（表1），說明我們篩選得到的菌株同樣為高效解磷細菌；將菌株分別接種至2 種土樣后培養(yǎng)30 d，土壤中的有效磷含量均顯著增加，其中，接種阿氏芽孢桿菌后，土樣1（低磷土壤）中有效磷增加了13.68%，土樣2（正常磷土壤）中的有效磷增加了12.07%，接種甲殼蟲WSH-0021 細菌后，土樣1 中有效磷增加了21.15%，土樣2 中有效磷含量增加了11.66%（表4），進一步證明了我們篩選得到的2 種解磷細菌的高效解磷能力。

降低周圍環(huán)境pH 值是解磷細菌的解磷機制之一[21]。降低pH 的過程中，環(huán)境中H+數(shù)量增多，H+與土壤中與磷酸根離子結(jié)合的鐵、鋁、鈣、鎂等金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)，減少金屬離子對磷結(jié)合位點的競爭，從而釋放磷酸根離子，增加有效磷含量[22]。比如解磷細菌腸桿菌（Enterobacter）通過分泌乙酸和葡萄糖酸降低環(huán)境pH 值，從而提高環(huán)境中有效磷含量和提高小麥生長[23]。假單胞菌屬解磷細菌通過呼吸作用或同化NH4+釋放H+，從而通過降低培養(yǎng)液pH 值進行解磷作用[24]。本次實驗結(jié)果顯示，2 種細菌生長曲線測定過程中，其培養(yǎng)基的pH 值均顯著下降，在土壤中接種細菌培養(yǎng)30 d后，2 種細菌同樣降低土樣1 和土樣2 的pH 值，證明我們篩選的解磷細菌亦是通過制造酸性環(huán)境進行解磷作用。

分泌磷酸酶是解磷微生物的另一種解磷機制[5]。磷酸酶是生物磷代謝的重要酶類，可通過水解土壤中含有機磷化合物釋放無機磷。磷酸酶的活性直接影響土壤有機磷的分解、轉(zhuǎn)化和生物有效性[25]。缺磷環(huán)境下，解磷細菌可通過分泌磷酸酶礦化有機磷酸鹽，促進有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷，提高植物的磷素吸收率[26]。磷酸酶活性與環(huán)境pH 和有效磷含量直接相關(guān)[27]。莊馥露等[28]研究顯示，其篩選出的10 株解磷菌均能向外分泌酸性磷酸酶，通過定量測定后發(fā)現(xiàn)，PsbM4 解磷細菌的酸性磷酸酶活性最高。畢銀麗等[29]發(fā)現(xiàn)，在土壤中接種解磷菌后，能顯著提高玉米根際土壤中酸性磷酸酶活性。王法威等[30]在土壤中接種A9 解磷菌，發(fā)現(xiàn)其顯著提高土壤中的酸性磷酸酶活性和有效磷含量，最終促進大豆的生長。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中接種2 種解磷菌后，顯著提高土壤中的酸性磷酸酶活性。其中，接種阿氏芽孢桿菌和甲殼蟲WSH-0021 細菌后，土樣1 中的酸性磷酸酶活性分別增加138.46%和73.07%，土樣2 中的酸性磷酸酶活性分別增加1 760.00%和3 400.00%，說明本實驗篩選得到的2 種解磷菌也通過向外分泌磷酸酶進行解磷。