胡曉宣,劉 倩,王童卓,孫美琪,張子宣,黃鵬瑜,羅宇佳,王 飔, 呂海俠

(1.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系;2.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系;3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院,陜西西安 710061)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH),俗稱出血性腦卒中,是一種非外傷性腦組織內(nèi)血管破裂引起的損傷性疾病,占全部腦卒中的20%～30%,有較高的死亡率和致殘率[1-2]。近年來,肥胖和高脂血癥已經(jīng)成為全球健康問題關(guān)注的重點(diǎn),被認(rèn)為是心腦血管意外、代謝綜合征及其他慢性疾病的主要危險(xiǎn)因素[3-4]。臨床觀察發(fā)現(xiàn),伴有高脂血癥或肥胖的中年患者是ICH 高發(fā)人群,結(jié)局嚴(yán)重,預(yù)后差;其腦內(nèi)出血灶面積大且血腫消除緩慢,神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重且恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)[5-7]。因此,開發(fā)有效的治療手段以改善高脂血癥或肥胖人群ICH 后的結(jié)局、加速神經(jīng)功能康復(fù),成為亟待解決的問題。

有研究證實(shí),嚙齒類動(dòng)物ICH 后側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(endogenous neural stem cells,eNSCs)被激活[8-12]。然而,eNSCs的有限激活不足以完成神經(jīng)損傷修復(fù)的任務(wù),因此,臨床工作中仍需要不斷探索新的基于NSCs的治療策略[13]。近年來,通過康復(fù)運(yùn)動(dòng)改善腦損傷癥狀促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)受到關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),運(yùn)動(dòng)促進(jìn)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)NSCs增殖和分化,刺激海馬神經(jīng)發(fā)生[14]。另外,運(yùn)動(dòng)可以減少ICH 引起的神經(jīng)元死亡[15];長(zhǎng)期自愿運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)神經(jīng)祖細(xì)胞的存活、增殖和向損傷灶遷移[16]。有關(guān)ICH 后運(yùn)動(dòng)干預(yù)的策略,目前觀點(diǎn)不一。有研究提示,自愿運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠SVZ 中NSCs的增殖和神經(jīng)發(fā)生沒有影響[17]。許多研究表明,運(yùn)動(dòng)可增加肥胖小鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá),增強(qiáng)海馬神經(jīng)元的突觸可塑性,提高學(xué)習(xí)與記憶能力[18-19],也可改善高脂血癥或肥胖導(dǎo)致的神經(jīng)發(fā)生減弱[20]。那么,高脂血癥或肥胖人群ICH 后能否通過合理的康復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練進(jìn)一步促進(jìn)eNSCs的激活,加速神經(jīng)功能修復(fù),還有待探索。

本研究基于前期的工作觀察,首先構(gòu)建高脂血癥小鼠ICH 模型,然后在損傷急性期開始短時(shí)間自愿運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,通過對(duì)比小鼠運(yùn)動(dòng)和平衡能力改善,評(píng)價(jià)短期自愿運(yùn)動(dòng)對(duì)神經(jīng)功能康復(fù)的影響,通過觀察SVZ的eNSCs激活情況,闡明其可能的機(jī)制,以期為開發(fā)針對(duì)高脂血癥人群ICH 的臨床治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Nestin-CreERT2:tdTomato轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠(南京大學(xué)模式動(dòng)物有限公司),血糖檢測(cè)儀(萊弗仕康醫(yī)療器械有限公司),高脂飼料(research diet D12492,4.30 kcal/g,60%脂肪,20%碳水化合物,20%蛋白質(zhì)),三酰甘油(triglyceride,TG)、血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、血清低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、血清高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)購(gòu)自南京建成生物工程有限公司,尼羅紅(Nile Red,Sigma公司),他莫昔芬(Sigma公司),H&E染色試劑盒(西安赫特生物科技有限公司),一抗包括兔抗Ki67(1∶300)和兔抗-DCX(1∶400)購(gòu)自Abcam 公司,二抗綠色熒光標(biāo)記驢抗兔IgG(1∶500)購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 高脂血癥小鼠腦出血模型的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)選用4月齡Nestin-Cre雄性小鼠14只,給予8周高脂飲食。遵循西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定(批準(zhǔn)號(hào):XJTU 2021-1265),所有小鼠飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗循環(huán)的SPF級(jí)動(dòng)物房,自由攝食及飲水。通過稱量體質(zhì)量,測(cè)定血糖、血清TG、TC、LDL-C、HDL-C及肝臟組Nile Red染色,驗(yàn)證小鼠高脂血癥模型構(gòu)建成功。以紋狀體注射膠原酶的方法制備ICH 模型。經(jīng)腹腔注射0.75%戊巴比妥鈉(0.01 mL/g)后,小鼠俯臥位固定于立體定位儀臺(tái)上;術(shù)區(qū)備皮及消毒,沿矢狀線剪開頭皮,充分暴露顱骨。在紋狀體注射0.03 U Ⅳ型膠原酶(以前囟為原點(diǎn),右旁開2.4 mm,前0.4 mm,深度3.4 mm),注藥時(shí)長(zhǎng)5 min,注藥后留針5 min,退針時(shí)長(zhǎng)2 min?？p合頭皮并消毒,紅霉素軟膏涂抹預(yù)防感染。造模前3 d,連續(xù)腹腔注射他莫昔芬(0.05 mg/g)誘導(dǎo)Nestin表達(dá);造模后小鼠置37℃的電熱毯上保暖,完全蘇醒后放回鼠籠。

1.3 動(dòng)物分組與自愿運(yùn)動(dòng)干預(yù)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共14 只,隨機(jī)分為5 組:空白對(duì)照組(Blank)2 只,假 手 術(shù) 組(Sham)3 只,ICH 組3 只,Sham+運(yùn)動(dòng)(Ex)組3只及ICH+Ex組3只。Blank組不進(jìn)行任何處理,Sham 組小鼠僅開顱進(jìn)針;以轉(zhuǎn)輪(直徑12.7 cm)作為自愿運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。ICH 前2 d,運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行適應(yīng)性練習(xí),其余小鼠在標(biāo)準(zhǔn)籠內(nèi)自由活動(dòng)。ICH 后2 d,運(yùn)動(dòng)組小鼠開始運(yùn)動(dòng)且持續(xù)7 d,以Statistical Analysis System 軟件記錄小鼠每日運(yùn)動(dòng)圈數(shù)和7 d運(yùn)動(dòng)總?cè)?shù)。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)估

所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)訓(xùn)練,以保證小鼠熟悉平衡木并能順利通過。ICH 后2 d及運(yùn)動(dòng)干預(yù)第1、3、5、7天采用雙盲法對(duì)小鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)指標(biāo)包括神經(jīng)功能缺損評(píng)分(neurological severity score,NSS)和平衡木(beam walking)。NSS評(píng)分越高表示神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。平衡木實(shí)驗(yàn)記錄小鼠肢體未從距離地面10 cm 的100 cm×1 cm 木條上滑脫/軀體未從木條跌落所運(yùn)動(dòng)的最遠(yuǎn)距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值作為小鼠通過橫梁的距離。

1.5 組織取材及染色

分別于ICH 后2 d及運(yùn)動(dòng)7 d留取肝臟組織及腦組織。小鼠經(jīng)0.75%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定,留取肝臟組織和腦組織進(jìn)行冰凍切片(厚度為10μm)。按照常規(guī)方法,以1μmol/L 的Nile Red染液進(jìn)行肝臟組織染色,37℃孵育30 min后光鏡下觀察脂滴數(shù)量。腦組織進(jìn)行HE染色,觀察腦出血損傷灶以及組織病理學(xué)改變;采用ki-67及DCX 免疫組織化學(xué)染色,觀察SVZ的eNSCs激活情況。

1.6 數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

小鼠體質(zhì)量、NSS評(píng)分、轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)量使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,血糖及血清脂質(zhì)代謝相關(guān)因子濃度、免疫熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析。免疫染色陽性細(xì)胞數(shù)量采用單因素方差分析(One-way ANOVA),體質(zhì)量及NSS 評(píng)分采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA),其余數(shù)據(jù)采用非配對(duì)t檢驗(yàn)(Unpairedttest)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高脂飲食誘導(dǎo)Nestin-Cre 雄性小鼠出現(xiàn)高脂血癥

實(shí)驗(yàn)開始前各組小鼠體質(zhì)量(表1)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,喂養(yǎng)8周后(6月齡),HFD組小鼠體質(zhì)量增加更明顯(P＜0.000 1),伴隨血糖水平明顯升高(圖1A,P=0.004 3)。肝臟組織Nile Red染色結(jié)果顯示,HFD組小鼠肝臟組織脂滴形成數(shù)量明顯增加(圖1B,P＜0.001),血清TG(P=0.027 9)、TC(P＜0.001)、HDL-C(P＜0.001)和LDL-C(P＜0.001)濃度明顯增加(圖1C),提示小鼠出現(xiàn)高脂血癥。

表1 高脂飲食喂養(yǎng)8周后小鼠體質(zhì)量的變化Tab.1 Changes in body weight of mice after 8-week HFD

2.2 短期自愿運(yùn)動(dòng)改善高脂血癥小鼠ICH后神經(jīng)功能

ICH 組小鼠紋狀體部位出現(xiàn)明顯損傷灶(圖2A)。NSS結(jié)果顯示(表2),Blank與Sham 組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),ICH 組小鼠評(píng)分明顯增高(P＜0.01),提示小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙。Beam walking結(jié)果顯示(表2),Blank 與Sham 組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),ICH 組小鼠通過距離明顯縮短(P＜0.001),提示小鼠平衡能力下降。

圖2 短期自愿運(yùn)動(dòng)改善ICH 小鼠神經(jīng)功能Fig.2 Short-term voluntary exercise improved ICH-induced neurological dysfunction

表2 ICH 后高脂血癥小鼠出現(xiàn)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙Tab.2 ICH induced neurological dysfunction in mice with hyperlipidemia

Sham+Ex和ICH+Ex組小鼠每日運(yùn)動(dòng)圈數(shù)和7 d運(yùn)動(dòng)總距離無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2A、圖2B),提示兩組小鼠運(yùn)動(dòng)意愿和運(yùn)動(dòng)能力具有可比性。隨運(yùn)動(dòng)天數(shù)增加,ICH+Ex組小鼠NSS逐漸降低,通過平衡木距離逐漸增加;7 d后與ICH 組有明顯差異,接近對(duì)照組(Sham 及Sham+Ex)水平(圖2C、圖2D,P＞0.05)。提示短期自愿運(yùn)動(dòng)明顯改善高脂血癥小鼠ICH 后神經(jīng)功能。

2.3 短期自愿運(yùn)動(dòng)促進(jìn)高脂血癥小鼠ICH后eNSCs激活

分別對(duì)各組小鼠SVZ 的Nestin+細(xì)胞(紅色)、Nestin+/Ki67+及Nestin+/DCX+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),以觀察eNSCs 激活。結(jié)果顯示,ICH 組小鼠SVZ 的Nestin+/Ki67+細(xì)胞數(shù)量明顯低于Sham 組(P＜0.05);運(yùn)動(dòng)組(Sham+Ex及ICH+Ex)小鼠SVZ的Nestin+細(xì)胞(P＜0.05)及Nestin+/Ki67+(P＜0.001)細(xì)胞數(shù)量明顯高于Sham 和ICH 組(圖3A),運(yùn)動(dòng)組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示短期自愿運(yùn)動(dòng)明顯增強(qiáng)高脂血癥小鼠eNSCs增殖。

側(cè)腦室前外側(cè)角的DCX+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,ICH組Nestin+/DCX+細(xì)胞明顯多于Sham 組(P＜0.05);Sham+Ex(P＜0.001)和ICH+Ex(P＜0.01)組小鼠Nestin+/DCX+細(xì)胞數(shù)量明顯高于Sham 組,與ICH組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B),運(yùn)動(dòng)組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示ICH 及短期自愿運(yùn)動(dòng)均增強(qiáng)了高脂血癥小鼠eNSCs向神經(jīng)元方向分化,而7 d自愿運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂血癥小鼠ICH 后eNSCs向神經(jīng)元分化的促進(jìn)作用不明顯。

3 討 論

我國(guó)居民膳食調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示,居民營(yíng)養(yǎng)失衡狀態(tài)日益加劇[21-22]。長(zhǎng)期高脂飲食誘發(fā)的高脂血癥或肥胖,已成為危害健康的重要因素。臨床數(shù)據(jù)及研究證實(shí),脂質(zhì)代謝紊亂不僅影響神經(jīng)發(fā)育和腦認(rèn)知功能,也容易誘發(fā)腦卒中[23-24]。伴有高脂血癥的ICH患者癥狀重、恢復(fù)慢且預(yù)后差。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的小鼠高脂血癥模型構(gòu)建方法,本研究給予Nestin-Cre雄性小鼠8周高脂飲食,成功建立了小鼠高脂血癥,并伴有血糖水平明顯升高及肝臟組織脂滴形成增多[25-26]。

研究證實(shí),長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)在改善腦卒中患者的心血管狀態(tài)、提高認(rèn)知功能、增強(qiáng)身體耐力與平衡及提升生活質(zhì)量等方面發(fā)揮重要作用[27]。同時(shí),運(yùn)動(dòng)能夠顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥,對(duì)高脂血癥引起的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用[28-29]。但是,短期運(yùn)動(dòng)對(duì)腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的研究相對(duì)較少,有關(guān)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練策略也存在爭(zhēng)議。本研究在高脂血癥小鼠ICH 模型中,觀察到明顯的腦組織損傷及神經(jīng)功能障礙;基于前期研究觀察,選擇在ICH 急性期開始1周自愿運(yùn)動(dòng)。結(jié)果顯示,運(yùn)動(dòng)組小鼠神經(jīng)功能明顯改善,NSS評(píng)分降低,Beam walking距離增加,7 d后與對(duì)照組(Sham 及Sham+Ex)小鼠功能接近,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與已有的關(guān)于非高脂血癥小鼠ICH 的研究結(jié)果基本一致,即1周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可顯著降低NSS評(píng)分,小鼠平衡能力恢復(fù)至對(duì)照組水平[30]。

基于NSCs的中樞神經(jīng)損傷修復(fù)策略已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究和臨床治療共同關(guān)注的焦點(diǎn)。前期研究證實(shí),腦卒中后eNSCs一定程度被激活,參與損傷修復(fù)過程[8-12,31]。本研究證實(shí)高脂血癥小鼠發(fā)生ICH后,處于增殖狀態(tài)(Nestin/Ki67雙陽性)的eNSCs數(shù)量顯著減少,而其向神經(jīng)元分化(DCX 陽性)數(shù)量顯著增加,提示高脂血癥小鼠ICH 后存在eNSCs的有限激活,但由于較多細(xì)胞被動(dòng)員向神經(jīng)元分化,導(dǎo)致eNSCs儲(chǔ)備下降,參與神經(jīng)修復(fù)的能力明顯下降。經(jīng)過7 d自愿運(yùn)動(dòng),運(yùn)動(dòng)組小鼠無論是Nestin/Ki67雙陽性細(xì)胞,還是Nestin/DCX 雙陽性細(xì)胞,均顯著高于Sham 組,提示自愿運(yùn)動(dòng)有效促進(jìn)了高脂血癥小鼠ICH 急性期eNSCs激活,有望通過產(chǎn)生更多的eNSCs及新生神經(jīng)元的方式加速損傷修復(fù)。值得關(guān)注的是,ICH+Ex與ICH 組小鼠相比,Nestin/DCX雙陽性細(xì)胞數(shù)量增加不明顯,提示因運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練而增加的eNSCs分化成為新生神經(jīng)元可能需要更長(zhǎng)時(shí)間。此結(jié)果也在一定程度上解釋了臨床觀察到患有高脂血癥的ICH 患者神經(jīng)功能恢復(fù)慢的結(jié)果。

綜合以上結(jié)果,本研究證實(shí),ICH 急性期短時(shí)程自愿運(yùn)動(dòng)可改善高脂血癥小鼠的神經(jīng)功能障礙,促進(jìn)eNSCs激活;但由于高脂血癥本身對(duì)NSCs行為的影響,通過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促進(jìn)新生的eNSCs分化成神經(jīng)元以加速神經(jīng)功能康復(fù)可能需要更長(zhǎng)時(shí)間。后續(xù)研究將通過延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)天數(shù)進(jìn)一步促進(jìn)eNSCs向神經(jīng)元方向分化,增強(qiáng)修復(fù)效果,通過觀察運(yùn)動(dòng)后損傷局部環(huán)境及糖脂代謝改變,闡明自愿運(yùn)動(dòng)促進(jìn)ICH 后神經(jīng)功能康復(fù)的細(xì)胞與分子機(jī)制,為開發(fā)基于eNSCs的高脂血癥人群ICH 臨床治療策略、加速其神經(jīng)功能康復(fù)提供新的思路與理論依據(jù)。