張 丹,馮 云,劉亞萍,趙 倩,黃 晉,和水祥

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,陜西西安 710061;2.陜西科技大學(xué)電子信息與人工智能學(xué)院光電系,陜西西安 710021)

腫瘤的早期診斷是目前腫瘤研究的重要方向。分子影像通過對(duì)活體的生物學(xué)過程在細(xì)胞和分子水平進(jìn)行的描述和測(cè)量實(shí)現(xiàn)疾病的早期篩查[1]。隨著各種影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展,目前分子影像學(xué)診斷的關(guān)鍵是選擇合適的靶分子及獲得針對(duì)靶分子的特異性親和探針。CD44是目前已明確的胃癌標(biāo)志物,尤其是可變型外顯子編碼區(qū)CD44v,相對(duì)CD44固有型外顯子編碼區(qū)CD44s,具備更高的腫瘤特異性。CD44v中,CD44v6靶向藥物開發(fā)較多,部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。而CD44v9作為CD44家族中高特異性結(jié)構(gòu)域,尚缺乏相應(yīng)的探針開發(fā)。本團(tuán)隊(duì)致力于胃癌多肽探針的開發(fā),曾經(jīng)使用噬菌體多肽展示技術(shù)對(duì)CD44s、CD44v6進(jìn)行篩選并獲取多肽探針,發(fā)現(xiàn)單一探針在信號(hào)強(qiáng)度、靈敏性、特異性方面尚存在較大的提升空間。因而,針對(duì)高特異性腫瘤標(biāo)志物的探針,對(duì)加強(qiáng)腫瘤灶信號(hào)、提升早癌檢出率有重要意義。本研究使用CD44v9 為靶點(diǎn),開發(fā)并驗(yàn)證其特異性配體多肽序列。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),人胚腎HEK-293 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。CD44v9外顯子編碼區(qū)由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成,噬菌體展示12肽庫(kù)購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司。

1.2 噬菌體展示肽庫(kù)篩選

1.2.1篩選 分別將10 g/L BSA 或100μg/m L CD44v9溶于8.4 g/L Na HCO3(p H 8.4),加入至酶標(biāo)板,4℃過夜。加入30 g/L BSA 封阻滿孔,孵育2 h。使用TBS(10 mmol/L Tris,p H 7.4)將10μL噬菌體展示肽庫(kù)(New England Biolabs,US)稀釋至100μL,加入10 g/L BSA孔內(nèi),37℃搖動(dòng)孵育2 h。將10 g/L BSA孔內(nèi)未結(jié)合的噬菌體上清加入100μg/mL CD44v9孔內(nèi),37℃搖動(dòng)孵育2 h。后去除未結(jié)合噬菌體上清,0.1%TBST(Tween-20 1 g/L)洗板10次。后將100μL洗脫緩沖(0.2 mol/L Glycine-HCl p H 2.2,1 mg/m L BSA)加入CD44v9孔內(nèi)作用15 min,取出洗脫液,使用15μL 中和緩沖液(1 mol/L Tris-HCl p H 9.1)中和。

1.2.2擴(kuò)增滴定 復(fù)蘇E.coliER2738,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,取1μL后將上一步所獲取噬菌體洗脫液進(jìn)行滴定。將洗脫液使用LB 液體培養(yǎng)基分別稀釋至10-6、10-7、10-8、10-9、10-10稀釋度,分別依次與菌液、3 m L 頂層瓊脂糖迅速混勻,后加至LB/IPTG/Xgal固體培養(yǎng)基平板。37℃培養(yǎng),次日選擇含有102數(shù)量級(jí)藍(lán)色噬菌斑的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算回收率:回收率=回收噬菌體/投入噬菌體。

將1.2.1步驟中所獲得全部噬菌體洗脫液加入20 m LE.coliER2738對(duì)數(shù)期菌液中,225 r/min振蕩培養(yǎng),37℃、4.5 h,培養(yǎng)物使用4℃10 000 r/min離心10 min,使用PEG/NaCl 4℃過夜沉淀噬菌體,4℃10 000 r/min 離心15 min,棄上清,沉淀使用TBS重懸,重復(fù)上述沉淀過程,最終沉淀使用200μL TBS 0.2 g/L NaN3噬菌體保存液溶解,為次級(jí)庫(kù),對(duì)次級(jí)庫(kù)按上述方法再進(jìn)行滴定。

1.2.3后續(xù)篩選 重復(fù)步驟1.2.1,進(jìn)行后續(xù)3輪淘選,其中所加噬菌體文庫(kù)為上一輪所獲得次級(jí)庫(kù),洗滌液中Tween濃度增加至5 g/L。每輪淘選結(jié)束按照1.2.2方法進(jìn)行滴定及擴(kuò)增至次級(jí)庫(kù)。對(duì)第4輪洗脫物不擴(kuò)增,僅進(jìn)行滴定。

1.3 測(cè)序

1.3.1噬菌體單克隆化 從第4輪篩選滴定的平板中選擇102水平平板,隨機(jī)挑取30個(gè)藍(lán)斑,即噬菌體單克隆。將E.coliER2738菌液在37℃、225 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4.5 h至對(duì)數(shù)期。將每個(gè)噬菌體單克隆加入1 m L 上述菌液中,繼續(xù)按上述條件培養(yǎng)6 h,將培養(yǎng)物離心,收集上清為噬菌體單克隆貯液。

1.3.2噬菌體DNA 提取及測(cè)序 將500μL噬菌體單克隆貯液加入200μL PEG/NaCl,4℃沉淀噬菌體10 min,高速離心后去除上清。將沉淀使用100μL碘化物緩沖液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,4 mmol/L NaI)重懸,再加入250μL 無水乙醇常 溫沉淀DNA?；旌衔锔咚匐x心10 min,去除上清,用700 m L/L的乙醇漂洗沉淀,短時(shí)真空干燥。最終將沉淀使用TE 緩沖液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)30μL重懸。

取上述噬菌體單克隆DNA 貯液,送上海生工生物工程公司,使用-96gⅢ測(cè)序引物(5＇-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3＇)行全自動(dòng)測(cè)序。根據(jù)噬菌體多肽展示文庫(kù)附帶使用手冊(cè)對(duì)噬菌體測(cè)序結(jié)果進(jìn)行讀取及翻譯。

1.4 ELISA鑒定候選噬菌體

將噬菌體單克隆進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增滴定。分別將10 g/L BSA 或100μg/m L CD44v9 溶 于8.4 g/L Na HCO3(p H 8.4),加入至酶標(biāo)板,4℃過夜。加入30 g/L BSA 封阻滿孔,孵育2 h。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每組分別加入1011待測(cè)克隆或?qū)φ湛寺?37℃孵育1 h,0.5%TBST 洗板6次。加入封阻液稀釋的山羊抗M13噬菌體衣殼蛋白多克隆抗體(1∶1 000,Santa Cruz,US),37℃孵育1 h,常規(guī)洗滌后再加入封阻液稀釋的HRP 標(biāo)記兔抗山羊抗體(1∶5 000,Bioss,CN),37℃孵育1 h,常規(guī)洗滌。TMB 顯色試劑盒顯色,使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm 處讀取吸光度。計(jì)算選擇力,即CD44v9孔A值/BSA 孔A值。

1.5 多肽合成

將選擇的多肽序列,連同亂序?qū)φ招蛄?由多肽合成儀合成(上海強(qiáng)耀生物技術(shù)公司),氮端標(biāo)記羅丹明或生物素。純度95%以上,合成產(chǎn)物由高分液相色譜鑒定。

1.6 細(xì)胞免疫熒光

在前期工作中,已驗(yàn)證人胚腎HEK-293細(xì)胞僅表達(dá)野生型CD44s,不表達(dá)CD44v[2],并構(gòu)建CD44v3-v10重組質(zhì)粒并驗(yàn)證在HEK-293細(xì)胞中過表達(dá)[3]。重組CD44v 質(zhì)粒及空載質(zhì)粒使用脂質(zhì)體(Invitrogen,US)轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞。制備細(xì)胞爬片,去除培養(yǎng)基,PBS洗滌3次,加入40 g/L 多聚甲醛固定液,于4℃固定15 min,常規(guī)洗滌。30 g/L BSA 37℃封閉30 min,洗滌后加入封閉液稀釋的FITC標(biāo)記待測(cè)多肽及對(duì)照多肽(10μmol/L),37℃孵育10 min,PBS洗滌,加入DAPI染核5 min,洗滌后甘油封片,熒光顯微鏡拍照。

1.7 免疫組化檢測(cè)探針與人胃癌組織結(jié)合

人胃癌組織芯片購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司,芯片包含23例首診胃癌組織及相應(yīng)的癌旁非癌組織。術(shù)前未進(jìn)行過放化療、生物治療等腫瘤相關(guān)治療。置組織芯片于烘箱60℃烘烤20 min,后浸泡于二甲苯中20 min,梯度乙醇水化。置于TE 緩沖液(p H 9.0)于微波爐內(nèi)加熱行抗原修復(fù)。3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶活性。5%FBS 37℃封閉1 h。實(shí)驗(yàn)組滴加生物素標(biāo)記多肽探針(10μmol/L),對(duì)照組滴加封閉液稀釋的小鼠抗人CD44單克隆抗體(1∶100,Santa Cruz,US),后續(xù)以生物素標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(1∶500,Bioss,CN)。所有芯片滴加封閉液稀釋的HRP標(biāo)記鏈霉親和素(1∶200),37℃孵育1 h。DAB試劑盒顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察切片,統(tǒng)計(jì)染色得分,具體方法如下:著色細(xì)胞占總細(xì)胞比例0、0～10%、10%～50%、50%～80%、80%以上分別記0、1、2、3 分;著色強(qiáng)度記為1 分(淺著色)、2分(中等著色)及3分(強(qiáng)著色);將著色細(xì)胞數(shù)量比例得分與著色強(qiáng)度得分相乘所得即為染色得分。一個(gè)標(biāo)本中任選5個(gè)高倍視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì),最終該標(biāo)本染色得分為5個(gè)分?jǐn)?shù)均值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0(SPSS,US)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,計(jì)量數(shù)據(jù)組間差異比較采用t檢驗(yàn),變量間關(guān)聯(lián)采用Perason相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體展示肽庫(kù)篩選

為了篩選與CD44v9結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)結(jié)合的特異性多肽配體。CD44v9 外顯子編碼區(qū)純化蛋白被包被至固相表面(酶標(biāo)板)作為篩選靶點(diǎn)。1011數(shù)量級(jí)的噬菌體文庫(kù),包含109級(jí)別復(fù)雜度,首先與包被BSA 的陰性篩選孔結(jié)合,未結(jié)合噬菌體被投入CD44v9包被孔內(nèi)進(jìn)行篩選。每輪篩選后,對(duì)獲得的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增,可以使優(yōu)勢(shì)噬菌體進(jìn)行指數(shù)級(jí)別的富集。每輪篩選的回收率,即回收噬菌體/投入噬菌體,是篩選是否成功的參數(shù)。表1 示4 輪篩選的投入、回收、回收率數(shù)值?？梢?隨著篩選進(jìn)行,在投入噬菌體數(shù)量級(jí)穩(wěn)定的情況下,回收噬菌體及回收率的數(shù)量級(jí)呈現(xiàn)升高,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),相鄰輪次回收率兩兩比較,差異存均在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。圖1反應(yīng)了4輪篩選回收率呈現(xiàn)的趨勢(shì),說明在篩選過程中,優(yōu)勢(shì)克隆富集情況明顯,篩選有效。

圖1 4輪噬菌體篩選回收率Fig.1 Recovery rates of four rounds of screening

表1 4輪篩選的投入、回收噬菌體及回收率Tab.1 Input phages,output phages and recovery rate of four rounds of pannings

2.2 噬菌體序列分析

在篩選結(jié)束后,對(duì)收取噬菌體進(jìn)行滴定,隨機(jī)選取30個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行測(cè)序。通過限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行插入DNA 定位,后通過M13 噬菌體密碼子表進(jìn)行翻譯,可獲得噬菌體所攜帶的多肽序列。在30個(gè)噬菌體單克隆中,如表2所示,出現(xiàn)序列重復(fù)富集現(xiàn)象,其中重復(fù)次數(shù)最高的序列為C9-3,共10次,其余序列 有C9-1(1 次)、C9-2(6 次)、C9-4(2 次)、C9-5(4次)、C9-6(3 次)、C9-7(1 次)、C9-8(2 次)、C9-9(1次)。重復(fù)次數(shù)多的序列相較重復(fù)序列少的序列親和力及特異性更優(yōu)的概率更大,是序列選擇的重要參考標(biāo)準(zhǔn)。

表2 噬菌體序列、重復(fù)情況及選擇力Tab.2 Amino acid sequences,frequency and selectivity of screened peptides

2.3 噬菌體序列ELISA鑒定

噬菌體ELISA 用于鑒定待測(cè)序列,尋找高親和力及選擇性的噬菌體克隆。所有待測(cè)序列,包括隨機(jī)對(duì)照序列克隆(unrelated random phage,Urps)均與CD44v9包被孔(靶蛋白)及BSA 包被孔(對(duì)照蛋白)進(jìn)行結(jié)合檢驗(yàn)。圖2展示了噬菌體ELISA 的檢驗(yàn)結(jié)果。噬菌體與CD44v9結(jié)合的吸光度絕對(duì)值代表結(jié)合的親和力?？梢娢舛冉^對(duì)值最高的5個(gè)序列按順序分別為C9-3、C9-2、C9-5、C9-1、C9-6,其中C9-3、C9-2兩個(gè)克隆絕對(duì)值超過1.5。表2展示了所有待測(cè)序列的選擇力,即噬菌體與靶蛋白、對(duì)照蛋白吸光度比值,這代表了噬菌體與靶蛋白結(jié)合的特異性?？梢娺x擇力最高的5個(gè)序列按順序分別為C9-3、C9-5、C9-2、C9-6、C9-1,其中C9-3、C9-5兩個(gè)克隆選擇力大于4。綜上,C9-3序列具備最佳的親和力及特異性,同時(shí)也是重復(fù)率最高的序列,因此被選擇為探針序列進(jìn)行合成檢測(cè)。

圖2 噬菌體克隆ELISA鑒定結(jié)果Fig.2 ELISA of each individual phage clone

2.4 多肽探針檢測(cè)細(xì)胞表面CD44v9

羅丹明標(biāo)記的C9-3 多肽分別用于檢測(cè)CD44v過表達(dá)細(xì)胞及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞。如圖3 展示,C9-3多肽結(jié)合于CD44v過表達(dá)的HEK-293 細(xì)胞,熒光信號(hào)明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK-293 細(xì)胞。羅丹明標(biāo)記的亂序?qū)φ针挠糜诮Y(jié)合CD44v過表達(dá)的HEK-293細(xì)胞時(shí),也未發(fā)現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)。

圖3 C9-3多肽與CD44v9表達(dá)情況不同的HEK-293細(xì)胞結(jié)合情況Fig.3 Binding of C9-3 peptide to HEK-293 cells with different CD44v9 expression

2.5 多肽探針檢測(cè)胃癌組織表面CD44v9

圖4A 展示了胃癌組織中C9-3探針與CD44v9抗體染色情況,可見棕色著色位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中,分布位置基本一致。圖4B 為組化評(píng)分統(tǒng)計(jì)圖。多肽探針結(jié)合胃癌組織組化評(píng)分為5.09±3.84,癌旁組織為2.01±0.85,二者間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=3.953,P＜0.01)。23例胃癌組織中,有11例(47.83%)經(jīng)多肽探針結(jié)合呈強(qiáng)染色,10 例(43.48%)經(jīng)CD44v9免疫組化檢測(cè)結(jié)果為高表達(dá),其中9例二者均為強(qiáng)染色。癌旁組織中,未發(fā)現(xiàn)探針強(qiáng)染色及CD44v9高表達(dá)。如圖4C 所示,經(jīng)線性回歸分析顯示,C9-3探針染色及CD444v9免疫組化評(píng)分間存在線性正相關(guān)關(guān)系(r=0.823,P＜0.01)。

圖4 C9-3多肽探針與胃癌及相應(yīng)癌旁組織結(jié)合情況Fig.4 Binding of C9-3 peptide to gastric cancer and corresponding paracancerous tissues

3 討 論

CD44是重要的腫瘤標(biāo)志物,其通過不同的剪切表達(dá),分子結(jié)構(gòu)主要分為標(biāo)準(zhǔn)型CD44(CD44s)及可變型CD44(CD44v)。CD44分子為跨膜糖蛋白,包含有胞外段、跨膜段、胞內(nèi)段3個(gè)部分,其中胞內(nèi)段與跨膜段位于碳端,高度保守,編碼區(qū)位于CD44基因的18、19、20號(hào)外顯子。胞外段由1至17號(hào)外顯子編碼,包括有CD44分子生理功能區(qū)域——透明質(zhì)酸結(jié)合域,以及v1-v10可變型外顯子編碼區(qū)域,由于可變性外顯子存在多種剪切形式,因此CD44v分子種類繁多,胞外段長(zhǎng)度可在200～700氨基酸不等[4]。

CD44分子是具備重要生理功能的細(xì)胞黏附分子及淋巴調(diào)節(jié)因子,但生理功能多與CD44s中所包含功能區(qū)相關(guān)。CD44v更多被研究的是其與腫瘤的關(guān)系。Rho A 與CD44v3形成復(fù)合物后,會(huì)激活Rho激酶,并磷酸化包括CD44v3、CD44v8-v10在內(nèi)的幾種蛋白,促使這些CD44分子與錨蛋白結(jié)合,從而調(diào)控腫瘤發(fā)展[5]。CD44v9 可以通過穩(wěn)定雄激素受體誘發(fā)抗凋亡效應(yīng)[6]。CD44v6可以與HGF形成復(fù)合物并將其呈遞至受體,引發(fā)受體激酶樣效應(yīng)并激活Ras等下游通路,HGF 可以引發(fā)多種腫瘤的轉(zhuǎn)移效應(yīng);HGF 經(jīng)IFG-1、TGF-β、PEG-2 及 腫 瘤 壞 死 因 子激活可以刺激CD44v9 的產(chǎn)生[7]。CD44v7-v10 因MAPK 通路重要因子MEK、p38被抑制后同樣出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的抑制[8]?？梢园l(fā)現(xiàn),CD44v促進(jìn)腫瘤機(jī)制的研究中,CD44v9是報(bào)道比較多的CD44v分子。

CD44是重要的胃癌標(biāo)志物,在胃癌中的表達(dá)較正常胃黏膜組織明顯上升。CD44 在正常胃黏膜中表達(dá)較少,而在癌前狀態(tài)包括慢性萎縮性胃炎及腸化黏膜中表達(dá)局限于基底腺上皮細(xì)胞,癌組織中表達(dá)明顯升高[9]。胃癌中關(guān)于CD44v的表達(dá)情況報(bào)道較多的是CD44v6,目前也有關(guān)于CD44v6的配體藥物開發(fā)報(bào)道[10]。CD44v9被證實(shí)在胃癌組織中表達(dá)高于非癌組織[11-12];且有報(bào)道發(fā)現(xiàn),CD44v6 在正常胃黏膜中有表達(dá),但CD44v9不表達(dá)于HP陰性正常胃黏膜,提示CD44v9 具備更高的腫瘤特異性[13]。目前現(xiàn)有研究中,尚缺乏CD44v9的探針開發(fā)。

分子影像中成像技術(shù)已有高水平發(fā)展,可以滿足閃爍掃描、光學(xué)、磁共振、超聲等多平臺(tái)分子水平成像,但目前制約分子影像學(xué)臨床應(yīng)用的原因是缺乏高靈敏、高特異、能產(chǎn)生明確病灶信號(hào),并且穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的配體探針。本課題組曾通過噬菌體多肽展示技術(shù),篩選并鑒定多條針對(duì)于CD44s、CD44v 的多肽探針[2-3,14]。發(fā)現(xiàn)單一探針在信號(hào)強(qiáng)度、靈敏性、特異性方面可能不足以滿足臨床要求。因而,使用不同靈敏度、特異性的探針進(jìn)行復(fù)合,可以克服單一探針存在問題,在實(shí)際工作中達(dá)到提高檢出率及檢出特異性的目的。

因?yàn)楸敬魏Y選目標(biāo)是高特異性腫瘤標(biāo)志物CD44v9,因此保證探針的高特異性是本次篩查的重點(diǎn)。對(duì)于靶點(diǎn),我們選擇v9外顯子合成區(qū)進(jìn)行合成,最大程度避免其他結(jié)構(gòu)的混入。篩選方面使用了陰性消減,減少非特異性噬菌體的結(jié)合。篩選過程中及篩選后的測(cè)序體現(xiàn)出了噬菌體的富集作用。后通過ELISA 驗(yàn)證,獲得了最佳序列。經(jīng)驗(yàn)證該序列的合成肽,可以特異性結(jié)合于CD44v過表達(dá)HEK-293細(xì)胞。一方面證實(shí)C9-3噬菌體被篩選是因?yàn)槠浔磉_(dá)肽的結(jié)合而非噬菌體非特異性結(jié)合;另一方面也證實(shí)了C9-3多肽不僅結(jié)合于固相包被的CD44v9,也可以結(jié)合于細(xì)胞表面表達(dá)的CD44v9。

通過對(duì)胃癌組織的結(jié)合,C9-3 多肽的診斷價(jià)值被進(jìn)一步驗(yàn)證。相對(duì)我們?cè)谝酝ぷ髦兴Y選的CD44s、CD44v6 探針,C9-3 在胃癌組織中的陽性率相對(duì)較低,但在癌旁非癌組織中,無一例陽性,明顯低于我們既往獲得探針,證明C9-3探針與其靶點(diǎn)一致,是胃癌的高特異性探針。因此,在后續(xù)工作中,幾條探針將被用于復(fù)合檢驗(yàn)?zāi)[瘤,以求達(dá)到臨床中需求的檢測(cè)強(qiáng)度及檢測(cè)特異性。