齊 婷,劉成峰,石 爽,王軍奎,王西強,李飛鵬

(1.陜西省人民醫(yī)院心血管內一科,陜西西安 710068;2.華陰市人民醫(yī)院,陜西渭南 714200)

B淋巴細胞是原始小鼠心臟中最常見的免疫細胞之一[1]。既往研究表明,在急慢性心肌損傷中,調節(jié)心肌B 淋巴細胞可以發(fā)揮心臟保護的作用[2-4]。研究顯示,在正常生理狀態(tài)下,B 淋巴細胞在初級和次級淋巴器官之間循環(huán),直到結合其同源抗原[5-6]。并且有研究顯示,小鼠心臟內存在大量B淋巴細胞。然而,心臟內B 淋巴細胞的基本生物學特點及其發(fā)育和轉運過程尚不清楚。由于B淋巴細胞在心肌損傷中發(fā)揮著重要作用[4],因此,闡明心臟內B淋巴細胞在初始狀態(tài)下的生物學特性有助于探討B(tài) 淋巴細胞在心臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用,并評估靶向B 淋巴細胞干預在心臟疾病治療中的潛力。本研究擬使用B 淋巴細胞缺失小鼠,探討B(tài) 淋巴細胞缺失對心臟發(fā)育過程中心臟結構、功能及心肌免疫細胞組成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用10～14 周齡雌性C57BL/B6J 野生型(WT)小鼠及B6.129S2-Ighmtm1Cgn/J(μMT)小鼠進行實驗,μMT 小鼠為純和的B 淋巴細胞缺陷小鼠。小鼠均飼養(yǎng)于無病原體環(huán)境中,按照指南自由給予食物及水。所有實驗均根據(jù)西安交通大學醫(yī)學院動物委員會批準的動物協(xié)議進行。

1.2 心臟超聲檢查

超聲檢查使用Vevo 770 超聲系統(tǒng)(VisualSonics Inc,Toronto,Ontario,Canada)。腹腔注射0.005 mL/g的20 g/L tribromoethanol麻醉小鼠,根據(jù)超聲檢查時間,可每隔30 min以初始劑量的1/5作為維持劑量。使用化學脫毛劑從前胸脫掉毛發(fā),將小鼠以左側臥位放置在保暖墊上,以維持體溫(37℃),用直腸溫度計監(jiān)測體溫。胸口部位涂抹適量超聲凝膠,注意保持適當接觸的同時,避免過度按壓胸部。通過手持操作超聲換能器獲得二維多普勒圖像。超聲檢測左心室質量(LVM)、左心室射血分數(shù)(LVEF)。

1.3 形態(tài)學和組織學觀察

提前準備好小鼠CO2處死箱,控制CO2流量約2 L/min。將小鼠放入CO2處死箱處死小鼠。處死小鼠后,取心臟稱重,確定心臟質量與脛骨長度的比值(HW/TB)。心臟經過處理,使用麥胚凝集素(WGA)染色心肌細胞細胞膜,用Zeiss共聚焦顯微鏡觀察熒光,用Zeiss Axiovision軟件分析和測量數(shù)字圖像,以確定心肌細胞橫截面積。

1.4 流式細胞術分析

處死小鼠后,取心臟使用10 m L HBSS溶液從右心室底部沖洗心臟。將心臟放入盛有Hank's平衡鹽溶液(HBSS)的培養(yǎng)皿(直徑100 mm)中,擠出心臟中的殘留血液。去除心臟表面液體,稱量左心室,使用刀片切碎左心室,均為2 min。之后,將左心室塊置于含有3 m L HBSS的15 m L離心管中,并換洗1次。向盛有標本的各離心管中分別加入膠原酶(450 U/mL)、透明質酸酶(60 U/m L)、DNAseⅠ(60 U/m L)。將所有標本置于37℃震蕩器中恒溫、勻速消化45 min后,加入6 m L HBB 終止消化。采用40μm 濾膜過濾,將濾液轉入新的15 mL離心管,4℃、400 r/min離心7 min。棄上清,每個樣品加入1 m L ACK lysis buffer,混勻后于冰上靜置12 min,加入5 m L FACS buffer,4℃、400 r/min再次離心7 min。棄上清,加入45μL FACS buffer,吸取1/3離心液轉入1.5 mL離心管中,加入目標抗體混合物,使用美國BD LSRⅡ流式細胞儀進行實驗檢測。流式細胞術設門策略見圖1。

圖1 流式細胞術設門策略Fig.1 Gating strategy for the flow cytometric analysis

1.5 RNA提取及RNA測序分析

RNA 提取使用Trizol Plus RNA Purification Kit(catalog number:12183-555)及Pure Link DNase(Cat.No.12185-010))。簡要步驟如下:將心肌細胞在搗碎機搗碎,放于EP 管里。每孔加入500μL Trizol,使用移液管混勻后,轉移到1.5 m L EP管中。加入100μL 氯仿,用手用力搖動15 s。室溫孵育2～3 min。4℃下12 000×g 離心15 min。制備Pure Link DNase混合液。將200μL 無色上層液體轉移到新鮮的無Rnase管中。每個樣品加入200μL 700 m L/L乙醇并充分混勻。將400μL 樣品轉移到帶有收集管的離心管中。12 000×g在室溫下離心15 min,丟棄過濾液,將離心管重新放于收集管中。加350μL洗滌緩沖液Ⅰ,12 000×g在室溫下離心15 s丟棄過濾液,將離心管重新放于收集管中。將80μL Pure-Link DNase混合物直接添加到Spin Cartridge膜表面。室溫下孵育15 min。添加350μL 洗滌緩沖 液Ⅰ,12 000×g在室溫下離心15 s丟棄過濾液,將離心管重新放置到收集管中。加入500μL洗滌緩沖液Ⅱ,12 000×g在室溫下離心15 s。12 000×g室溫下離心1 min。加入30μL 無Rnase水,室溫孵育1 min。13 000×g室溫下離心2 min,隨后收集RNA。將RNA 進行測序分析[7]。

1.6 統(tǒng)計學分析

使用Graph Pad prism 8.0(Graphpad software,Inc.,Cary,NC)進行統(tǒng)計分析和繪圖。變量采用均數(shù)±標準誤表示,兩組間比較采用Student’st檢驗,兩組以上比較采用One-way Anova檢驗。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 B淋巴細胞缺失改善心臟結構及功能

與WT 小鼠相比,μMT 小鼠HW/BW 及左心室質量明顯減低(P＜0.05,圖2A、圖2B);WGA 染色結果同樣顯示,與WT 小鼠相比,μMT 小鼠心臟的心肌細胞橫截面積明顯減小(P＜0.001,圖2C、圖2D)。心臟超聲結果提示,與WT 小鼠相比,μMT 小鼠的左心室射血分數(shù)明顯上升(P＜0.05,圖2E)。為了進一步驗證上述結果,我們使用m RNA 測序的方法從基因水平驗證上述發(fā)現(xiàn),結果顯示,WT 小鼠及μMT 小鼠在m RNA 水平上明顯不同(圖3A、圖3B)。GO 富集分析顯示,WT 小鼠及μMT 小鼠的差異基因主要富集在心臟發(fā)育上(圖4)。KEGG 富集分析顯示,WT 小鼠及μMT 小鼠的差異基因富集在肥厚性心肌病信號通路上(圖5)。

圖2 WT小鼠與μMT小鼠心臟的結構及功能改變Fig.2 Structural and functional changes of the heart in WT andμMT mice

圖3 WT與μMT小鼠心肌細胞基因表達變化Fig.3 Gene expression changes in cardiomyocytes of WT andμMT mice

圖4 心肌細胞差異基因GO 分析Fig.4 Gene Ontology(GO)analysis

圖5 心肌細胞差異基因KEGG 富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.2 B淋巴細胞缺失改變心臟免疫細胞組成

流式細胞術結果顯示,與WT 小鼠相比,μMT 小鼠心肌具有更少的Ly6g+的中性粒細胞(P＜0.001,圖6A、圖6B)、CD4+陽 性T 淋 巴 細 胞(P＜0.01,圖6C、圖6D)及CD8+T 淋巴細胞(P＜0.05,圖6C、圖6E)。

圖6 WT小鼠與μMT小鼠心肌免疫細胞的改變Fig.6 Changes ofcardiac immune cells in WT andμMT mice

3 討 論

20世 紀60 年 代,GOWANS 和KNIGHT 進 行了B淋巴細胞再循環(huán)的經典研究[5]。此后,免疫學家認為,B淋巴細胞在初級淋巴器官和次級淋巴器官之間不斷循環(huán),而不會在周圍組織中堆積[6]。然而,近期研究發(fā)現(xiàn),原始心臟中存在一個相對較大的B淋巴細胞池[8],而且B 淋巴細胞亞群與心肌細胞微血管內皮密切接觸,并在通過心臟時在心肌細胞停留[9]。但是,關于心臟內B 淋巴細胞的基本生物學特點及其發(fā)育和轉運過程尚不清楚。本研究結果顯示,B淋巴細胞調節(jié)心肌細胞免疫細胞的組成,降低左心室質量,并增加心肌收縮力,揭示了循環(huán)B淋巴細胞與心肌細胞的生物學關系,對免疫細胞只有在外滲和進入實質后才能在組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用的觀點提出了挑戰(zhàn)。

本研究結果顯示,與WT 小鼠相比,μMT 小鼠心肌細胞內的CD4+細胞及CD8+T 細胞明顯減少。這一結果既往文獻也有報道,認為B 細胞在組織損傷的情況下調節(jié)T 淋巴細胞的運輸[8]。此外,本研究發(fā)現(xiàn),與WT 小鼠相比,μMT 小鼠具有更小的心室質量、更小的心肌細胞橫截面積和更高的左心室射血分數(shù)。而WT 小鼠與μMT 小鼠差異基因主要富集在心臟發(fā)育及肥厚型心肌病的富集通路上,揭示了B淋巴細胞在心臟生長發(fā)育中的重要作用。研究顯示,心臟B淋巴細胞趨化因子信號通路上調并表達多種細胞因子,如TGF-β1。有研究認為,B淋巴細胞敲除后對心肌質量的影響可能是由于淋巴細胞和心肌細胞之間間接的旁分泌所致[9]。

現(xiàn)有證據(jù)表明,心肌損傷可觸發(fā)B 淋巴細胞的聚集。YAN 等[1]首先報道了小鼠缺血損傷后心肌免疫細胞的動態(tài)變化,結果顯示B 淋巴細胞在心肌梗死后第1天顯著增加,在損傷后第7天達到高峰,即使在心肌梗死后14 d,B 淋巴細胞水平仍然很高。HORCHMAN 等[4]發(fā)現(xiàn)心肌梗死后心外膜脂肪組織中B淋巴細胞增加。HEINRICHS等[10]研究了B淋巴細胞向受損心肌募集的機制,發(fā)現(xiàn)CXCL13-CXCR5軸可能是心肌梗死后B淋巴細胞在心臟聚集的關鍵驅動因素。雖然B淋巴細胞和心臟損傷的大部分數(shù)據(jù)是通過缺血性損傷模型獲得的,但在白喉毒素(Rosa26-DTMlc2v-Cre)誘導的心臟損傷、基因缺陷心肌損傷模型[7]和壓力誘導的心肌損傷模型[11]中均觀察到了心肌B 淋巴細胞數(shù)量的增加,這表明心臟細胞損傷都可能觸發(fā)B淋巴細胞在心臟中的聚集。

本研究證實并擴展了既往報道的心肌B 淋巴細胞研究結果,揭示了B 淋巴細胞缺失改變心肌免疫細胞的組成、降低左心室質量并增加心肌收縮力的作用,揭示了循環(huán)B 淋巴細胞與心肌細胞生物學之間的關系。但是,本研究僅為現(xiàn)象觀察研究,未對B 淋巴細胞敲除后對心臟結構、功能及心肌免疫細胞組成影響的潛在機制進行探討,其發(fā)生機制需要進一步研究。