張秋歌,喻燕妮,戴偉,欒亞寧

(北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院/森林培育與保護(hù)教育部重點實驗室,北京 100083)

自然環(huán)境中大量被遺棄的塑料在長時間物理(機(jī)械磨損)、化學(xué)(紫外光降解)和生物(生物降解)作用下發(fā)生破碎所形成的尺寸較小、形狀各異的微塑料[1-2]和納米塑料(nanoplastics,NPs)[3],成為全球性環(huán)境污染的重要原因[4-6]。納米塑料主要指粒徑低于1 000 nm的塑料顆粒[7-10],在環(huán)境和生物體內(nèi)的累積效應(yīng)不僅會導(dǎo)致環(huán)境污染,且極可能引發(fā)生物毒性[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)納米塑料廣泛分布于土壤[11]、水體[6]和大氣[2],其中,農(nóng)林業(yè)地膜的使用、污水污泥的灌溉、有機(jī)肥的施用、大氣沉降以及垃圾填埋場滲濾液下滲等多途徑的影響使土壤具有最高的納米塑料分布豐度[12]。

已有研究表明,納米材料因具有比表面積大、吸附力強(qiáng)和易官能化等獨特性質(zhì)[13]使其與生物大分子相互作用形成冠狀物,即蛋白冠[14],從而改變納米材料原有的界面性質(zhì)和生物大分子的構(gòu)象和活性,并可能引發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)[15]。納米塑料與納米材料相似,同樣具有比表面積大、吸附力強(qiáng)和易官能化等特征。脲酶不僅可以催化尿素迅速水解為二氧化碳和氨,利于氮的轉(zhuǎn)化以及植物的氮素營養(yǎng)吸收,還可以通過參與蛋白氮的轉(zhuǎn)運通路增強(qiáng)植物的防御抗逆性,對植物和土壤有著必不可少的重要意義[16],因此脲酶的研究受到更多的關(guān)注。但納米塑料和土壤酶是否可以形成蛋白冠、形成后對納米塑料和土壤酶原有性質(zhì)是否產(chǎn)生影響、影響強(qiáng)度如何等一系列相關(guān)科學(xué)問題的研究至今尚未展開,限制了人們對納米塑料在環(huán)境中影響作用的認(rèn)識。為此,本研究以不同電性的納米塑料和不同濃度的脲酶為研究對象,研究不同電性納米塑料在不同濃度脲酶條件下蛋白冠的形成,探究蛋白冠對納米塑料形貌特征以及脲酶構(gòu)象和活性的影響。研究結(jié)果可為今后深入探究真實土壤環(huán)境中納米塑料對植物生長的影響提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不帶電、帶正電和帶負(fù)電的3種平均粒徑為200 nm的納米塑料均購自天津大鵝科技有限公司。刀豆脲酶(CAS號:9002-13-5,易溶于水,4～8 ℃儲存),購自西亞化學(xué)科技(山東)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 納米塑料-脲酶混懸液的制備將1 mg·mL-1的納米塑料混懸液分別與0.05、0.20和0.50 mg·mL-1脲酶溶液進(jìn)行等體積混勻,置于37 ℃、150 r·min-1恒溫振蕩器孵育4 h,制備得到不同處理條件的混懸液?；鞈乙河? ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 納米塑料-脲酶蛋白冠的分離和純化吸取2 mL混懸液置于離心管,超高速冷凍離心機(jī)4 ℃離心20 min(離心力17 000g),收集上清液,再次向離心管中加超純水至刻度線處,離心并收集上清液,重復(fù)3次。收集后的上清液在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 納米塑料-脲酶蛋白冠形貌特征分析利用真空冷凍干燥機(jī)對1.2.1節(jié)提取的沉淀物進(jìn)行干燥。將樣品置于制樣片上,用離子濺射鍍膜儀進(jìn)行表面鍍膜,最后用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察顆粒形貌特征。另外,在制樣片上滴1滴不同處理的混懸液,干燥后通過原子力顯微鏡掃描分析顆粒表面粗糙度。

1.2.4 納米塑料-脲酶蛋白冠水合粒徑和Zeta電位測定分別將1 mL不同處理的混懸液置于粒徑和電位的專用測量皿中,進(jìn)行DLS水合粒徑分析和Zeta電位檢測。

1.2.5 納米塑料對脲酶吸附量的測定考馬斯亮藍(lán)法分別測定混懸液和1.2.2節(jié)獲取的上清液中脲酶含量,利用差減法計算納米塑料對脲酶的吸附量(q),計算公式:q=(C1-C2)/C1×100%。式中:C1和C2分別為混懸液中脲酶總量和上清液中脲酶量(%)。

1.2.6 納米塑料-脲酶蛋白冠構(gòu)象的測定用不同電性納米塑料與0.05 mg·mL-1脲酶制備獲得的混懸液進(jìn)行穩(wěn)態(tài)熒光及圓二色性光譜分別測定脲酶的三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu),空白對照為純水與0.05 mg·mL-1脲酶溶液等體積混合的溶液。熒光測定條件:激發(fā)波長為280 nm,發(fā)射光譜掃描范圍300～500 nm;圓二色性光譜測定條件:N2條件下狹縫寬度為1 nm,檢測波長為190～240 nm。使用Spectra Manager軟件對CD光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑預(yù)處理,保存后用Peakit 2.0進(jìn)行基線校正與分峰擬合,波數(shù)范圍選擇190～240 nm,進(jìn)行擬合計算得到二級結(jié)構(gòu)相對含量。熒光光譜由Origin繪制。

1.2.7 脲酶活性的測定利用試劑盒(G20210714S,江蘇艾迪生生物科技有限公司)通過靛酚藍(lán)比色法測定吸光度A(紫外分光光度計測定波長578 nm,蒸餾水調(diào)零)。每毫升液體每分鐘產(chǎn)生1 μg的NH3-N定義為1個酶活力的單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與討論

2.1 不同電性納米塑料對脲酶吸附量的影響

3種不同電性納米塑料均能吸附脲酶,吸附量隨脲酶質(zhì)量濃度的增加而增加(表1)。其中,帶正電納米塑料對脲酶的吸附量顯著高于其他處理,當(dāng)脲酶質(zhì)量濃度為0.50 mg·mL-1時,吸附量可達(dá)48.68%±6.86%。不帶電和帶負(fù)電納米塑料對脲酶吸附量差異不顯著。有研究表明,納米顆粒和蛋白質(zhì)之間的相互作用受納米顆粒自身電荷和蛋白質(zhì)濃度的影響[16-17],本研究也進(jìn)一步證實納米塑料對脲酶吸附量存在電荷差異和濃度效應(yīng),推測帶正電的納米塑料通過吸附脲酶形成蛋白冠的可能性最大[18]。

表1 不同質(zhì)量濃度脲酶條件下3種納米塑料對脲酶的吸附量Table 1 Effects of three nanoplastics with different charges and mass concentrations of urease on the adsorption capacity %

圖1 不同質(zhì)量濃度脲酶處理后納米塑料蛋白冠電子顯微鏡(SEM)掃描圖Fig.1 SEM image of nanoplastics protein corona treated by different mass concentrations of urease

2.2 不同電性納米塑料-脲酶蛋白冠的形成

原納米塑料顆粒具有表面光滑、形狀規(guī)則和顆粒邊界清晰等特征。但與脲酶發(fā)生吸附反應(yīng)后,3種納米塑料顆粒間均出現(xiàn)不同程度的粘連現(xiàn)象。具體表現(xiàn)為:1)相同脲酶質(zhì)量濃度下正電納米塑料粘連現(xiàn)象最明顯;2)隨脲酶質(zhì)量濃度增加,相同電性納米塑料粘連現(xiàn)象愈加嚴(yán)重(圖1)。這些現(xiàn)象明確反映出3種電性納米塑料都能和脲酶形成蛋白冠,但蛋白冠的形成強(qiáng)度隨條件的不同表現(xiàn)出明顯的差異性。

脲酶是含Ni+的金屬酶,等電點為4.6～4.8[19],但在純水環(huán)境下,其等電點大于4.8,帶負(fù)電。這一特征更利于其與正電納米塑料相互吸引形成蛋白冠,改變納米塑料顆粒原有形貌。脲酶質(zhì)量濃度越高,帶正電納米塑料對脲酶的吸附量越大(表1),因此降低了同種電荷的排斥力,提高了納米顆粒間相互交聯(lián)的橋梁作用[20-21],進(jìn)一步促進(jìn)了納米顆粒的聚集和蛋白冠的形成。帶負(fù)電納米塑料和不帶電的納米塑料以及脲酶的電性特征不利于脲酶的吸附,導(dǎo)致相同脲酶質(zhì)量濃度下脲酶的吸附量和顆粒間粘連現(xiàn)象都明顯低于正電納米塑料,2種納米塑料可能通過其他途徑吸附脲酶。因此,納米塑料的帶電性以及脲酶的帶電性和濃度是影響蛋白冠的形成及改變顆粒形貌的關(guān)鍵因素。

2.3 蛋白冠對納米塑料性質(zhì)的影響

2.3.1 對表面粗糙度的影響從圖2-A可知:不同脲酶質(zhì)量濃度處理下形成的蛋白冠使納米塑料表面失去其原有的平滑性,粗糙度均顯著高于原納米塑料(P<0.05)。結(jié)合掃描電子顯微鏡可以看出,隨脲酶質(zhì)量濃度的增加,納米塑料顆粒表面粗糙度增加。這與邢暢[17]的研究結(jié)果一致。

圖2 不同電荷的納米塑料與不同質(zhì)量濃度脲酶作用對其顆粒表面粗糙度(A)和水合粒徑(B)的影響Fig.2 Effect of different charges nanoplastics combined with different mass concentrations of urease on their particlesurface roughness(A)and hydrated particle size(B)不同大寫字母表示不同電荷處理間的粗糙度和水合粒徑的顯著性(P<0.05);不同小寫字母表示同種電荷不同質(zhì)量濃度脲酶處理間粗糙度和水合粒徑的顯著性(P<0.05)。Different capital letters indicate roughness and hydration particle size significance between different charge treatments(P<0.05);Different lowercase letters indicate the significance of the same charge,different mass concentration,roughness between urease treatments and hydration particle size(P<0.05).

2.3.2 對水合粒徑的影響脲酶吸附在納米塑料表面造成顆粒水合粒徑的改變,隨著脲酶質(zhì)量濃度的增加而顯著增加(P<0.05)(圖2-B)。3種電荷處理相比,帶正電的納米塑料與帶負(fù)電的脲酶結(jié)合形成的蛋白冠使納米塑料顆粒水合粒徑更大。這與大多數(shù)的研究結(jié)果相符,如魏慧芳[22]研究表示,氧化鐵納米顆粒與4種蛋白質(zhì)反應(yīng)形成蛋白冠后,其水合粒徑均大于原氧化鐵納米顆粒;夏凱[23]研究發(fā)現(xiàn),納米顆粒表面與4種不同的蛋白相互作用后形成的蛋白冠厚度不同,但是水合粒徑均增大。

也有人認(rèn)為,納米塑料的尺寸大小與其表面曲率密切相關(guān),是影響蛋白冠形成的重要因素[24]。Piella等[25]研究了不同尺寸納米金顆粒表面蛋白冠的形成過程,發(fā)現(xiàn)蛋白冠的厚度取決于納米金的尺寸,研究發(fā)現(xiàn)越小的顆粒,蛋白冠層越薄。結(jié)合動態(tài)光散射法測得的納米塑料水合粒徑不難發(fā)現(xiàn),帶正電的原納米塑料顆粒大于不帶電和帶負(fù)電的納米塑料顆粒,這表明納米顆粒的粒徑和表面修飾電荷是影響納米塑料吸附脲酶的重要因素,與大部分的研究結(jié)果相符[22-25]。

2.3.3 對混懸液穩(wěn)定性的影響在不同電荷及不同質(zhì)量濃度的處理條件下,蛋白冠的形成均不同程度改變了原納米塑料溶液的Zeta電位(圖3)。一方面,不帶電和帶負(fù)電的納米塑料與自身帶負(fù)電的脲酶反應(yīng),負(fù)電荷增多,Zeta電位絕對值顯著增加(P<0.05),溶液穩(wěn)定性提升;與之相反的是,帶正電的納米塑料溶液則表現(xiàn)出隨脲酶質(zhì)量濃度增加,所帶正電荷減少,Zeta電位減小,穩(wěn)定性降低[17]。另一方面,在納米塑料與脲酶結(jié)合過程中,溶液中結(jié)合和未結(jié)合蛋白處于動態(tài)平衡的狀態(tài),蛋白質(zhì)吸附在納米顆粒表面,相互作用較弱,形成“軟蛋白冠”[14],結(jié)構(gòu)松散,因此蛋白冠溶液分散性差,不穩(wěn)定。因同電相斥,所以帶負(fù)電微塑料溶液穩(wěn)定性最好;因異電相吸,所以正電微塑料溶液穩(wěn)定性最差;不帶電的介于兩者之間。

Dominguez-Melina等[26]認(rèn)為蛋白冠能提升納米顆粒膠體的穩(wěn)定性;Gebauer等[27]則表明蛋白冠的形成會造成納米顆粒的聚集。其中第1種結(jié)論認(rèn)為,蛋白冠層無法有效克服范德華引力,其中蛋白質(zhì)的性質(zhì)和親和力都會影響其聚集或沉淀的程度。第2種結(jié)論認(rèn)為,吸附的蛋白質(zhì)在納米顆粒之間起著物理橋梁的作用。Cukalevski等[20]提出了關(guān)于蛋白冠與納米顆粒穩(wěn)定性的機(jī)制,即在蛋白含量較低時,通常會作為能夠克服納米顆粒之間電荷排斥力的“保護(hù)殼”使其彼此靠近,從而導(dǎo)致納米顆粒的聚集。

2.4 蛋白冠對脲酶構(gòu)象和活性的影響

2.4.1 對脲酶構(gòu)象的影響蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來源于芳香族氨基酸殘基上的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr),內(nèi)源熒光的變化直接反映了蛋白質(zhì)中氨基酸殘基本身及其周圍環(huán)境的變化情況[22-23]。如圖4所示,脲酶在激發(fā)波長為280 nm時,在327 nm左右處有1個熒光發(fā)射峰,該熒光峰主要由脲酶肽鏈色氨酸殘基提供,酪氨酸次之。脲酶與3種電荷的納米塑料結(jié)合,芳香族氨基酸殘基的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸下降,并發(fā)生了明顯的藍(lán)移,說明3種納米塑料與脲酶肽鏈氨基酸殘基都發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用,脲酶表面Trp微環(huán)境疏水性增強(qiáng)。

在熒光峰移動過程中,295和312 nm處出現(xiàn)的2個明顯熒光峰可以說明酪氨酸和色氨酸都是納米塑料與脲酶相互結(jié)合反應(yīng)的作用位點,表明蛋白冠的形成使脲酶結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的重排,Tyr和Trp的相互作用可能明顯減弱。此外,3種電荷納米塑料的修飾位點相同,但熒光強(qiáng)度差異明顯,其中帶正電的納米塑料使脲酶分子表面的芳香族氨基酸在表面轉(zhuǎn)移至疏水核心,從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增大,導(dǎo)致脲酶可能具有更高的疏水性,對脲酶的影響最強(qiáng)烈。

由熒光光譜可知,納米塑料顆粒吸附脲酶,使脲酶分子構(gòu)象發(fā)生了明顯的重排,但是脲酶質(zhì)量濃度對其影響不顯著。為了進(jìn)一步研究脲酶構(gòu)象的變化,利用圓二色性光譜分析了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化情況。從圖5中可以看出,脲酶的圓二色性光譜在195 nm附近具有明顯的正吸收峰,在220 nm附近具有1個連續(xù)的負(fù)吸收峰。隨著脲酶與3種電荷的納米塑料的結(jié)合,其吸收峰位置發(fā)生較大改變,表明脲酶分子表面發(fā)生構(gòu)象重排,脲酶樣本的二級結(jié)構(gòu)相對含量如表2所示。

圖4 不同電荷納米塑料蛋白冠對脲酶(UE)熒光光譜的影響Fig.4 Effect of nanoplastics protein corona withdifferent charges on the fluorescencespectrum of urease(UE)

圖5 不同電荷納米塑料蛋白冠對脲酶圓二色性光譜的影響Fig.5 Effect of nanoplastics protein corona withdifferent charges on circular dichroismof urease

α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的重要組成部分。一般而言,α-螺旋和β-折疊都是依靠氫鍵維持[28],氫鍵的斷裂或新的氫鍵形成均會改變蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的相對含量[29],脲酶中α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量分別為39.25%和38.64%,合計占比超過70%,而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量較低,僅為13.47%和8.64%,說明氫鍵對脲酶執(zhí)行其功能起主要作用。但納米塑料-脲酶蛋白冠形成后,3種蛋白冠表現(xiàn)出相同的變化特征,即β-折疊結(jié)構(gòu)含量的降低和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量的增加,但3者變化強(qiáng)度不同。其中,帶正電的納米塑料-脲酶蛋白冠變化最為強(qiáng)烈;α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)合計占比降至49%左右,氫鍵作用降低,且主要表現(xiàn)為β-折疊結(jié)構(gòu)的破壞,其含量顯著降低,降幅達(dá)27.61%;與此相對應(yīng)的是無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量出現(xiàn)明顯的增加(增幅33.73%)。由此表明:3種納米塑料主要通過改變氫鍵作用強(qiáng)度影響脲酶的β-折疊結(jié)構(gòu)以及通過增加無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量對脲酶的構(gòu)象產(chǎn)生不同程度的影響。而三者間的強(qiáng)度差異主要是電性差異所致,這也進(jìn)一步證實納米塑料的帶電性是影響蛋白冠形成的重要因素。

表2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量(波段范圍190～240 nm)Table 2 Relative content of protein secondary structure(band range 190-240 nm) %

圖6 不同電荷納米塑料與不同濃度脲酶作用對脲酶活性的影響Fig.6 Effect of nanoplastics with different charges and different concentrations of urease on activity of ureaseCK:對應(yīng)質(zhì)量濃度條件下的純脲酶處理。UE1、UE2、UE3分別代表0.05、0.20和0.50 mg·mL-1的脲酶處理。CK:Urease treatment under the condition of corresponding mass concentra-tion. UE1,UE2 and UE3 represent treatments of 0.05,0.20 and 0.50 mg·mL-1 urease.

2.4.2 對脲酶活性的影響圖6顯示,不帶電和帶負(fù)電的納米塑料與脲酶形成蛋白冠前后,脲酶活性差異不顯著。帶正電的納米塑料與脲酶形成蛋白冠后,脲酶活性逐漸降低,在中等濃度(0.20 mg·mL-1)和高等濃度(0.50 mg·mL-1)處理條件下,顯著抑制了脲酶(P<0.05)。

納米顆粒的表面電性、疏水性是引發(fā)蛋白質(zhì)構(gòu)象和活性變化的重要因素。例如,帶電或疏水性的納米顆粒比親水性納米顆粒表面更容易引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[30]。溶菌酶在帶有負(fù)電荷的硅納米顆粒上吸附,損失70%的α-螺旋結(jié)構(gòu)和40%的酶活性[31]。單壁碳納米管吸附的胰凝乳蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)被損壞,酶活性喪失[32]。蛋白酶與SiO2納米顆粒的結(jié)合,可以導(dǎo)致腸道酶活性降低[17]。不同處理對脲酶活性的影響與脲酶結(jié)構(gòu)以及納米塑料的表面電荷有關(guān)[18]。本研究不僅印證了納米塑料表面電性和疏水性對蛋白質(zhì)的重要影響,同時還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)納米塑料主要是通過改變氫鍵作用強(qiáng)度降低脲酶的β-折疊結(jié)構(gòu)以及通過增加無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量對脲酶的構(gòu)象產(chǎn)生不同程度的影響,進(jìn)而導(dǎo)致活性的變化。

3 結(jié)論

不同電荷的納米塑料均能與脲酶結(jié)合形成蛋白冠,蛋白冠的形成使納米塑料表面粗糙度增加,顆粒之間出現(xiàn)聚集和粘連,混懸液分散性變差。納米塑料-脲酶蛋白冠的形成使脲酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了更明顯的重排,改變了脲酶的二級結(jié)構(gòu)。脲酶受構(gòu)象變化的影響,活性受到影響。與其他電性納米塑料相比,帶正電的納米塑料與脲酶形成的蛋白冠對納米塑料的形態(tài)特征及脲酶構(gòu)象與活性的影響更為顯著。