宋國(guó)紅,劉松濤,李林蔚,劉飛,張峰*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所,江蘇 南京 210014)

灰霉病是世界第二大真菌性病害,對(duì)作物產(chǎn)量造成了巨大損失[1],其病原菌灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea,簡(jiǎn)稱(chēng)灰霉菌)是一種死體營(yíng)養(yǎng)型、廣寄主性的絲狀子囊真菌,可侵染蔬菜、果樹(shù)和花卉等200多種作物,如番茄和草莓,引起番茄灰霉病和草莓灰霉病[2-4]。生產(chǎn)上對(duì)灰霉菌的防治以化學(xué)防治為主,目前常用的化學(xué)藥劑主要有苯并咪唑類(lèi)、氨基甲酸酯類(lèi)、二甲酰亞胺類(lèi)和苯胺類(lèi)等,然而長(zhǎng)期單一地使用某一類(lèi)化學(xué)藥劑不僅會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性,而且會(huì)造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染[5-6]。因此,急需開(kāi)發(fā)新型作用機(jī)制的化合物來(lái)解決以上問(wèn)題。

肌球蛋白(Myosin)屬細(xì)胞骨架蛋白,在肌動(dòng)蛋白絲上利用ATP水解產(chǎn)生的能量來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)肌動(dòng)蛋白絲并產(chǎn)生力量[7]。肌球蛋白在真核生物的多種生命過(guò)程中如胞質(zhì)分裂、內(nèi)吞作用、細(xì)胞形狀維持、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、胞內(nèi)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要作用[8-10]。肌球蛋白主要由三部分結(jié)構(gòu)域組成:氨基端的馬達(dá)結(jié)構(gòu)域(頭部結(jié)構(gòu)域)、頸部結(jié)構(gòu)域、可變的羧基端尾部結(jié)構(gòu)域,其中氨基端的馬達(dá)結(jié)構(gòu)域是最保守的,具有ATPase活性[11]。

氰烯菌酯(2-氰基-3-氨基-3-苯基丙烯酸乙酯)是一種新型2-氰基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑,其作用靶標(biāo)是Ⅰ型肌球蛋白(MyosinⅠ),主要用以防治禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌等引起的小麥赤霉病和水稻惡苗病,對(duì)其他病原菌如稻瘟病菌、灰霉菌和小麥白粉病菌等抑制作用較弱或幾乎沒(méi)有抑制作用[12-15]。本實(shí)驗(yàn)室前期在氰烯菌酯化合物結(jié)構(gòu)骨架基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成一批化合物,但這些化合物是否會(huì)對(duì)灰霉菌肌球蛋白具有抑制活性尚不清楚。

在本試驗(yàn)中,我們利用SF9昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)純化出具有活性的BcMyosinⅠ單體蛋白;從實(shí)驗(yàn)室化合物庫(kù)中成功篩選出B1和B17兩個(gè)對(duì)灰霉菌肌球蛋白具有抑制活性的化合物。本文通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)BcMyosinⅠ蛋白進(jìn)行體外表達(dá)和純化,并發(fā)現(xiàn)2個(gè)灰霉菌肌球蛋白抑制劑,未來(lái)可在B1和B17化合物結(jié)構(gòu)骨架基礎(chǔ)上優(yōu)化設(shè)計(jì)更高活性的肌球蛋白抑制劑,期望為灰霉病的綠色防控提供全新的解決方案,并延緩灰霉菌抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展速度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、載體及細(xì)胞灰霉菌B05.10菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院周明國(guó)教授惠贈(zèng)。DH5α菌株、DH10Bac菌株、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)SF9細(xì)胞和桿狀病毒表達(dá)載體pFastBac由農(nóng)藥靶標(biāo)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器2×TaqMaster Mix酶、2×Vazyme Lamp Master Mix和反轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)公司;氨芐青霉素鈉和RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;高保真酶2×FastPfu Premix、ToloPrep 柱式DNA膠回收試劑盒、ToloPrep 柱式質(zhì)粒提取試劑盒、核酸染料ToLo Safered Nucleic Acid Stain、T4DNA連接酶、同源重組酶2×Ezmax-single CloneMix Plus和GoldBand 5000 DNA Marker均購(gòu)自吐露港生物技術(shù)公司;限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)于大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司;SF9昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染試劑Sinofection購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司;His抗體購(gòu)自賽默飛有限公司;PMSF蛋白酶抑制劑購(gòu)自源葉生物;ADP-GloTMKinase Assay試劑盒購(gòu)自北京普洛麥格生物產(chǎn)品(Promega)有限公司;104μg·mL-1氰烯菌酯由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院周明國(guó)教授惠贈(zèng)。Heal Force Trident 960 PCR儀;Cytiva AKTA pure 25 蛋白純化儀;Vilber FUSION FX7 RGB SPECTRA生物大分子分析儀;Molecular Devices多功能酶標(biāo)儀SpectraMax M5。

1.2 方法

1.2.1 蛋白序列分析用Uniprot在線(xiàn)網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/)搜索BcMyosinⅠ信息(Gene ID:BC1G_10821),利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和ESPript(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)在線(xiàn)網(wǎng)站與已解析的禾谷鐮刀菌MyosinⅠ(FgMyosinⅠ)氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì),選取合適的蛋白表達(dá)長(zhǎng)度。

1.2.2 載體構(gòu)建以灰霉菌cDNA為模板,設(shè)計(jì)引物對(duì)A1/A2擴(kuò)增BcMyosinⅠ(1-737)片段,用EcoRⅠ和NheⅠ雙酶切pFastBac質(zhì)粒,膠回收試劑盒分別回收片段和酶切質(zhì)粒,同源重組酶連接目的片段和酶切質(zhì)粒,連接產(chǎn)物進(jìn)行DH5α轉(zhuǎn)化,挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證并送通用生物有限公司測(cè)序;以灰霉菌cDNA為模板,設(shè)計(jì)引物對(duì)A3/A4擴(kuò)增BcCaM(1-149)片段,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切pFastBac質(zhì)粒和片段,用T4DNA連接酶連接產(chǎn)物和片段,進(jìn)行DH5α轉(zhuǎn)化并挑單克隆送公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BioEdit軟件查看。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.3 病毒液制備與蛋白表達(dá)挑選測(cè)序正確的質(zhì)粒導(dǎo)入DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,挑選PCR驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子,提取桿粒DNA,轉(zhuǎn)染SF9昆蟲(chóng)細(xì)胞,27 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)6 d,4 ℃、2 000 r·min-1離心20 min,上清液即為P1代病毒液。將P1代病毒液按1∶100的體積比加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SF9細(xì)胞,27 ℃、125 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d,離心收集的上清液即為P2代病毒液。按同樣的方法收集P3代病毒液。將P3代病毒液pFast-BcMyosinⅠ(1-737)-H8和pFast-BcCaM(1-149)-H6按照2∶1的體積比加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SF9細(xì)胞,27 ℃、125 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d,離心后棄上清液,收集下部細(xì)胞碎片。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.2.4 親和層析與凝膠過(guò)濾層析純化將菌體用裂解緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl,300 mmol·L-1NaCl,25 mmol·L-1咪唑,5 mmol·L-1ATP,0.5% Triton X-100,10% 甘油,pH8.5)重懸后超聲波破碎儀破碎至澄清透明狀,超高速離心后收集上清液。上清液與提前用裂解緩沖液處理后的Ni-NTA Beads孵育2 h,用蛋白緩沖液W1(50 mmol·L-1Tris-HCl,300 mmol·L-1NaCl,25 mmol·L-1咪唑,10% 甘油,pH8.5)洗去雜蛋白,用蛋白緩沖液W2(50 mmol·L-1Tris-HCl,300 mmol·L-1NaCl,75 mmol·L-1咪唑,10% 甘油,pH8.5)洗去雜蛋白,用洗脫緩沖液E(50 mmol·L-1Tris-HCl,300 mmol·L-1NaCl,250 mmol·L-1咪唑,10% 甘油,pH8.5)洗脫目的蛋白,將目的蛋白上樣于提前用凝膠過(guò)濾層析緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl,200 mmol·L-1NaCl,10% 甘油,pH8.5)平衡后的Superdex 200 Increase 10/300GL柱子進(jìn)一步純化,判斷蛋白狀態(tài)。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析取純化后的目的蛋白洗脫液20 μL上樣于150 g·L-1蛋白凝膠,設(shè)置120 V、2 h進(jìn)行SDS-PAGE。切取凝膠,設(shè)置200 mA、2 h轉(zhuǎn)移凝膠上的蛋白至PVDF膜,膜用5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜,抗體孵育后進(jìn)行顯色,生物大分子分析儀拍照記錄結(jié)果。

1.2.6 ATPase活性的測(cè)定ATPase活性測(cè)定使用ADP-GloTM激酶檢測(cè)試劑盒。在100 μL PCR管中先加入由40 mmol·L-1Tris(pH7.5)、20 mmol·L-1MgCl2和0.1 mg·mL-1BSA 配制成的1×激酶反應(yīng)緩沖液A,再依次加入20 μmol·L-1化合物(B1和B17)、0.5 μmol·L-1BcMyosinⅠ(1-737)、0.1 μmol·L-1BcCaM和0.5 mmol·L-1ATP,吸打混勻后室溫孵育30 min,此時(shí)體系為16 μL;加入16 μL ADP-GloTMreagent,吸打混勻后室溫繼續(xù)孵育40 min;加入32 μL激酶檢測(cè)緩沖液吸打混勻,室溫孵育40 min后完成反應(yīng)。吸取20 μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至384孔白板內(nèi),放于酶標(biāo)儀下讀數(shù)并記錄試驗(yàn)結(jié)果。每個(gè)處理重復(fù)3次,試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7 化合物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制速率測(cè)定將化合物配制成終濃度為104μg·mL-1的母液,再用溶劑稀釋為20 mmol·L-1的次母液,按照次母液與PDA培養(yǎng)基1∶1 000體積比制成最終濃度為20 μmol·L-1的含藥培養(yǎng)基?；罨玫腂05.10菌株用無(wú)菌打孔器打取直徑5 mm的菌碟反向接種于含藥培養(yǎng)皿中央,25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗倒置培養(yǎng)2 d后用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。每個(gè)處理重復(fù)3次,試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。菌落生長(zhǎng)直徑=菌落直徑-菌餅直徑。抑制率=(對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑)/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑×100%。

1.2.8 同源模建預(yù)測(cè)BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)基于灰霉菌與禾谷鐮刀菌的MyosinⅠ馬達(dá)結(jié)構(gòu)域82.2% 的序列同源性,以解析的FgMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)為模板(PDB:6UI4),使用Discovery Studio 3.5軟件同源模建預(yù)測(cè)BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu),并用Pymol視圖軟件查看,用PROCHECK評(píng)價(jià)BcMyosinⅠ結(jié)構(gòu)的立體化學(xué)質(zhì)量。

1.2.9 分子對(duì)接用AutoDock-Vina軟件[16]和拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic algorithm,LGA),以半經(jīng)驗(yàn)勢(shì)函數(shù)作為能量打分函數(shù)對(duì)小分子的構(gòu)象和位置進(jìn)行全局搜索。計(jì)算過(guò)程中受體格點(diǎn)盒子為22 ?×22 ?×22 ?,格點(diǎn)間距為1 ?,格點(diǎn)盒子包圍住配體活性腔;能量評(píng)估和生成最大值分別設(shè)為250 000 和25 000;選擇均方根偏差(RMSD)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(最大容忍范圍為1 ?)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白表達(dá)序列的選取

根據(jù)同源比對(duì)結(jié)果和蛋白結(jié)構(gòu)域信息,選擇保留氨基端全長(zhǎng)的馬達(dá)結(jié)構(gòu)域和IQ1結(jié)構(gòu)域,即第1至第737位氨基酸(1-737)作為BcMyosinⅠ蛋白表達(dá)長(zhǎng)度;選擇灰霉菌鈣調(diào)蛋白(BcCaM)的全長(zhǎng)序列作為共同表達(dá)蛋白(圖1)。

圖1 BcMyosinⅠ蛋白和BcCaM蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.1 Schematic diagram of BcMyosinⅠprotein and BcCaM protein domains

2.2 pFast-BcMyosinⅠ(1-737)-H8和pFast-BcCaM(1-149)-H6載體的構(gòu)建

用引物對(duì)A1/A2和A3/A4分別擴(kuò)增出2 211 bp的BcMyosinⅠ(1-737)-H8 DNA片段和450 bp的BcCaM(1-149)-H6 DNA片段(圖2-A、B),分別用EcoRⅠ/NheⅠ和EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切pFast載體(圖2-C),用EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切BcCaM(1-149)-H6 DNA產(chǎn)物(圖2-D),用2×Ezmax-single CloneMix Plus酶和T4DNA連接酶分別連接2個(gè)片段的酶切質(zhì)粒和片段,進(jìn)行DH5α轉(zhuǎn)化,挑取單克隆送公司測(cè)序后用BioEdit軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

圖3 BcMyosinⅠ(1-737)-H8和BcCaM(1-149)-H6 的表達(dá)純化結(jié)果Fig.3 Expression and purification of BcMyosinⅠ(1-737)-H8 and BcCaM(1-149)-H6A. Ni-NTA柱純化BcMyosinⅠ(1-737)-H8和BcCaM(1-149)-H6 的SDS-PAGE;B. BcMyosinⅠ(1-737)-H8 和 BcCaM(1-149)-H6的Western blot結(jié)果。M. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品;W1. 緩沖液1;W2. 緩沖液2;E. 洗脫緩沖液。A. SDS-PAGE of BcMyosinⅠ(1-737)-H8 and BcCaM(1-149)-H6 purified by Ni-NTA column;B. Western blot results of BcMyosinⅠ(1-737)-H8 and BcCaM(1-149)-H6. M. Protein marker;W1. Buffer 1;W2. Buffer 2;E. Elution buffer.

2.3 BcMyosinⅠ(1-737)的表達(dá)純化

將pFast-BcMyosinⅠ(1-737)-H8和pFast-BcCaM(1-149)-H6 載體的P3代病毒液按照2∶1的體積比共表達(dá)于SF9細(xì)胞,利用 His8 和His6 標(biāo)簽對(duì) Ni-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂的親和作用,使用Ni-NTA Beads對(duì)蛋白進(jìn)行純化,用Anti-His單抗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BcMyosinⅠ和BcCaM蛋白均可正常表達(dá)純化(圖3)。

2.4 凝膠過(guò)濾層析檢測(cè)蛋白狀態(tài)

為進(jìn)一步判斷目的蛋白存在狀態(tài),將上述洗脫的目的蛋白上樣于Superdex 200 Increase 10/300GL純化柱,收集管中樣品進(jìn)行SDS-PAGE,參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白出峰圖推測(cè)BcMyosinⅠ(1-737)-H8和BcCaM(1-149)-H6復(fù)合體蛋白以單體形式穩(wěn)定存在(圖4),可用于后續(xù)測(cè)定ATPase活性。

圖4 BcMyosinⅠ(1-737)-H8 和BcCaM(1-149)-H6復(fù)合體蛋白凝膠過(guò)濾層析純化(A)和收集管SDS-PAGE電泳圖(B)Fig.4 Gel filtration(A)of BcMyosinⅠ(1-737)-H8 and BcCaM(1-149)-H6 complex proteinsand SDS-PAGE(B)for collectionsM. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Protein marker. 2～20. 收集管2～20 Collection 2-20.

2.5 化合物對(duì)BcMyosinⅠ的ATPase活性影響的測(cè)定

20 μmol·L-1條件下,化合物B1和B17對(duì)BcMyosinⅠ的ATPase活性抑制率分別為56.24% 和65.39%,較氰烯菌酯的抑制率(27.29%)均有明顯提高(圖5)。

圖5 20 μmol·L-1化合物對(duì)BcMyosinⅠ的ATPase活性抑制率Fig.5 Inhibition rates of ATPase activity of BcMyosinⅠby 20 μmol·L-1 compounds不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters represent significant differences(P<0.05).

2.6 抑制劑B1和B17對(duì)灰霉菌的活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定肌球蛋白抑制劑B1和B17在20 μmol·L-1條件下對(duì)灰霉菌的抑制活性,結(jié)果表明抑制劑B1和B17對(duì)灰霉菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為32.90% 和83.44%,較氰烯菌酯的抑制率(1.06%)均有明顯提高(圖6)。

圖6 20 μmol·L-1化合物對(duì)灰霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of 20 μmol·L-1 compounds on mycelial growth of Botrytis cinerea

2.7 預(yù)測(cè)的BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)

同源模建預(yù)測(cè)的BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)標(biāo)記為藍(lán)色,模板FgMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)標(biāo)記為綠色(圖7-A);PROCHECK統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(圖7-B)顯示 BcMyosinⅠ整體結(jié)構(gòu)98.7%的氨基酸殘基都存在于完全允許區(qū)域(紅色)和額外允許區(qū)域(黃色),表明預(yù)測(cè)的BcMyosinⅠ基本骨架構(gòu)象是合理的。

圖7 BcMyosinⅠ的三維結(jié)構(gòu)圖Fig.7 The 3D structure of BcMyosinⅠA. BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)圖的卡通模型The 3D structure of BcMyosinⅠin cartoon representation;B. BcMyosinⅠ模型的拉氏圖Ramachadran plot calculated for the BcMyosinⅠmodel.

2.8 抑制劑B1和B17與BcMyosinⅠ蛋白的分子對(duì)接

為研究抑制劑B1和B17與BcMyosinⅠ蛋白間的可能結(jié)合模式,我們進(jìn)行了分子對(duì)接。圖8中灰白色條帶為同源模建預(yù)測(cè)的BcMyosinⅠ三維結(jié)構(gòu)局部圖,用不同顏色標(biāo)記的分別為化合物B1和B17。對(duì)接結(jié)果表明化合物B1與BcMyosinⅠ的氨基酸殘基Lys217和Cys424形成氫鍵,結(jié)合能為-35.53 kJ·mol-1;化合物B17與BcMyosinⅠ的氨基酸殘基Thr218、Lys376和Asp541形成氫鍵,結(jié)合能為-36.78 kJ·mol-1;對(duì)照藥劑氰烯菌酯與BcMyosinⅠ的氨基酸殘基Thr218和Asp541形成氫鍵,結(jié)合能為-29.26 kJ·mol-1。結(jié)合能的高低與化合物和靶蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性有關(guān),可用于評(píng)估化合物對(duì)靶點(diǎn)的抑制活性強(qiáng)弱,結(jié)合能越低,化合物活性越強(qiáng),由分子對(duì)接結(jié)果也表明化合物B1和B17對(duì)BcMyosinⅠ的抑制活性均高于氰烯菌酯。

圖8 B1、B17和氰烯菌酯與BcMyosinⅠ的結(jié)合模式Fig.8 The binding patterns of B1,B17 and phenamacril with BcMyosinⅠA. B1與BcMyosinⅠ的結(jié)合模式圖Diagram of binding pattern of B1 and BcMyosinⅠ;B. B17與BcMyosinⅠ的結(jié)合模式圖Diagram of binding pattern of B17 and BcMyosinⅠ;C. 氰烯菌酯與BcMyosinⅠ的結(jié)合模式圖Diagram of binding pattern of phenamacril and BcMyosinⅠ.條帶表示BcMyosinⅠBands indicate BcMyosinⅠ;化合物(綠色)和關(guān)鍵殘基(白色)用棍狀圖表示Compounds(green)and key residues(white)are shown in stick plots;氫鍵用黃色虛線(xiàn)表示Hydrogen bonds are shown in dotted yellow lines.

3 討論

肌球蛋白屬于細(xì)胞骨架蛋白,在生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,肌球蛋白功能障礙與心肌病、耳聾、失明、腎病和神經(jīng)系統(tǒng)缺陷等疾病有關(guān)[17]。目前已開(kāi)發(fā)出一些肌球蛋白抑制劑,如五氯修地林(pentachloropseudilin,PCIP)、N-芐基-對(duì)甲苯磺酸胺(N-benzyl-p-toluenesulfonamide,BTS)和2,3-丁烷二酮一肟(2,3-butanedione monoxime,BDM)等[18]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,目前僅有氰烯菌酯一個(gè)肌球蛋白抑制劑,然而氰烯菌酯的選擇性極強(qiáng),僅對(duì)禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌引起的小麥赤霉病和水稻惡苗病有效,對(duì)農(nóng)業(yè)上為害很重的稻瘟病菌和灰霉菌等沒(méi)有抑制活性或活性很低。氰烯菌酯這一藥劑特征,嚴(yán)重限制其在植物病害化學(xué)防控中的大范圍應(yīng)用。

從本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成的氰烯菌酯衍生物庫(kù)中篩選得到對(duì)灰霉菌Ⅰ型肌球蛋白具有顯著抑制活性的B1和B17兩個(gè)化合物。從ATPase活性和菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)可以看出,B1和B17的可能作用位點(diǎn)為灰霉菌Ⅰ型肌球蛋白(BcMyosinⅠ)。另外,分子對(duì)接的結(jié)果也表明化合物B1和B17與BcMyosinⅠ分子對(duì)接的結(jié)合自由能均低于對(duì)照藥劑氰烯菌酯,證實(shí)B1和B17對(duì)BcMyosinⅠ的結(jié)合活性?xún)?yōu)于氰烯菌酯。

本文首次報(bào)道了灰霉菌MyosinⅠ的體外表達(dá)純化方法,并以此作為靶標(biāo)成功篩選得到對(duì)灰霉菌肌球蛋白具有顯著抑制活性的化合物B1和B17,其中化合物B17的生物活性高于B1。將B1與氰烯菌酯的分子結(jié)構(gòu)式進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)B1中取代芳環(huán)替代酯基可提高化合物對(duì)灰霉菌肌球蛋白的抑制活性,且磺酰胺基可作為電子等排體替換氰烯菌酯中的取代雙鍵;將B17與氰烯菌酯的分子結(jié)構(gòu)式進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)在芳環(huán)對(duì)位引入取代基可使小分子與BcMyosinⅠ蛋白Lys376殘基間形成氫鍵,增強(qiáng)蛋白與小分子化合物間的相互作用,有利于化合物活性的提高;通過(guò)比較B1和B17與BcMyosinⅠ的分子對(duì)接結(jié)果,發(fā)現(xiàn)B1與BcMyosinⅠ的氨基酸殘基Lys217和Cys424形成氫鍵,B17與BcMyosinⅠ的氨基酸殘基Thr218、Lys376和Asp541形成氫鍵,B17與較多氨基酸形成氫鍵從而降低結(jié)合自由能,推測(cè)B17對(duì)灰霉菌具有更高的抑制活性,與菌絲生長(zhǎng)和ATPase活性測(cè)定結(jié)果一致。今后可在氰烯菌酯的芳環(huán)對(duì)位引入其他取代基以增強(qiáng)與BcMyosinⅠ蛋白間的相互作用,以期得到更高活性的灰霉菌肌球蛋白抑制劑,進(jìn)而為灰霉病的綠色防控提供新的解決方案,為新農(nóng)藥創(chuàng)制提供新的發(fā)展方向。