陳海麗，沈康敏，陳躍偉，王莉，陸俊宏，李盛村，屠文展

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325027；2.浙江省針灸康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫州市康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027

阿霉素是最常見的化療藥之一，但其心臟毒性限制了阿霉素在癌癥化療中的應(yīng)用。研究表明，沒有原發(fā)性心肌病時(shí)阿霉素可誘導(dǎo)急性心肌病模型，模型小鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕，心臟重量減小，心肌損傷標(biāo)志物增加[1]。阿霉素也可誘導(dǎo)慢性心臟毒性動(dòng)物模型，模型小鼠心臟出現(xiàn)炎癥、氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡[2]。此外，阿霉素可引起小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞破壞，內(nèi)皮損傷標(biāo)志物增加[3]。

合理運(yùn)動(dòng)是心臟康復(fù)的重要手段，也有提高免疫力和清除癌癥細(xì)胞的能力。耐力運(yùn)動(dòng)（尤其是高強(qiáng)度重復(fù)次數(shù)）可以促進(jìn)骨骼肌、心肌生理性適應(yīng)，心肌和骨骼肌增厚，這種運(yùn)動(dòng)“預(yù)處理”方式，可以抵抗阿霉素造成的肌肉萎縮表型[4]。除了耐力運(yùn)動(dòng)，抗阻運(yùn)動(dòng)（每組10次，每次3組，每周3次，持續(xù)8周）也可以改善阿霉素所致慢性心肌病舒張動(dòng)脈壓、心率、交感神經(jīng)張力和氧化應(yīng)激[5]。此外，低中強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)減輕了阿霉素引起的心肌萎縮，恢復(fù)了心肌細(xì)胞橫截面積[6]。然而，運(yùn)動(dòng)改善阿霉素心肌病的分子機(jī)制仍不完全清楚。

盡管3- 羥甲基戊二酰-C o A 合成酶2（3-hydroxymethyl glutaryl-CoA synthase 2,HMGCS2）是酮體合成的限速酶[7]，且補(bǔ)充酮體可能對(duì)心衰患者有益[8]。但在其他心肌病研究中發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)抑制HMGCS2能改善脂毒性心肌病[9]；類似的，在非酒精性脂肪肝中，抑制HMGCS2也能夠減少肝纖維化和肝臟脂肪沉積等病理改變[10]。截至目前，仍鮮有研究揭示HMGCS2在阿霉素引起的心肌病中的作用。本研究探討運(yùn)動(dòng)調(diào)控HMGCS2在預(yù)防阿霉素所致的心功能降低過程中的作用，以期為尋找治療阿霉素心肌病的新靶點(diǎn)提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：6～8周齡雄性C57BL/6小鼠購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001]，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)條件：恒溫20～22 ℃，每天接受12 h光照。小鼠自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 試劑與儀器：阿霉素購自北京索萊寶生物試劑有限公司。Vevo2100小動(dòng)物超聲成像儀購自加拿大Visualsonics公司。TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。HMGCS2一抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)造模：小鼠隨機(jī)分為靜養(yǎng)對(duì)照組（Con組）、阿霉素組（Dox組）、運(yùn)動(dòng)+阿霉素組（Exe組），每組6只。Con組靜養(yǎng)，Dox組采用腹腔注射20 mg/kg阿霉素，Exe組在腹腔注射阿霉素之前進(jìn)行30 d游泳運(yùn)動(dòng)。Exe組運(yùn)動(dòng)安排如下：在方形塑料框（60 cm×50 cm×40 cm）中裝30 ℃溫水，將小鼠置于塑料框中開展游泳運(yùn)動(dòng)。第1 周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，水位高度7 cm，從第2周開始游泳時(shí)間從10 min逐漸增加至40 min，水位高度15 cm，迫使小鼠保持40 min游泳，正式游泳時(shí)間30 d。30 d游泳結(jié)束4 h后，注射阿霉素制造心肌損傷模型。

1.2.2 小鼠心臟功能評(píng)價(jià)及心臟組織取材：阿霉素注射后第4天，將其用異氟烷麻醉并脫毛，超聲探頭獲取心尖四腔位，M模式下獲取心臟超聲影像，并計(jì)算心臟射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction, EF），短軸縮短率（fractional shortening, FS），和E/A比值。阿霉素注射后第5 天，采用水合氯醛麻醉后，打開小鼠胸腔，剪取心臟，迅速擠壓出心腔內(nèi)血液，并剪去心底部血管，冷凍。

1.2.3 心肌細(xì)胞橫截面積評(píng)估：組織用4%多聚甲醛固定，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，用WGA熒光染料染色1 h，含DAPI的防熒光猝滅封片劑封片。在奧林巴斯熒光顯微鏡下，攝取圖片，用ImageJ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 心臟組織mRNA表達(dá)檢測(cè)：用TRIzol等提取和分離總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，評(píng)定RNA純度，利用試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后對(duì)樣本cDNA進(jìn)行PCR定量。使用的引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.2.5 心臟組織蛋白表達(dá)檢測(cè)：用適量裂解液、磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑等裂解組織，剪刀剪碎組織后勻漿，BCA法測(cè)定蛋白濃度，配好蛋白體系后，利用SDS-PAGE凝膠電泳法使蛋白分離，再用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉，總caspase-3（T-caspase-3，1:1 000，美國Proteintech公司），激活的caspase-3（C-caspase-3，1:1 000，美國Proteintech公司），HMGCS2（1:1 000，美國Santa Cruz公司）和GAPDH（1:5 000，美國Proteintech公司）一抗過夜，二抗孵育等步驟后，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）中利用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液（蘇州新賽美生物科技有限公司）使蛋白顯影。

1.2.6 HL-1細(xì)胞培養(yǎng)及HMGCS2抑制：HL-1細(xì)胞由上海冠導(dǎo)生物工程有限公司提供，使用DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL青霉素和10 U/mL鏈霉素）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2）。細(xì)胞貼壁至80%左右，用0.02%姨酶消化細(xì)胞，接種于24孔板，進(jìn)行細(xì)胞正式實(shí)驗(yàn)。在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入50 nmol/L HMGCS2 siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），處理24 h后，加入阿霉素（2 μmol/L），干預(yù)16 h，并進(jìn)行細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)測(cè)試。

1.2.7 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力：細(xì)胞活力按照上海碧云天公司的CCK8試劑盒說明書檢測(cè)，試劑加入15 min后，以450 nm波長檢測(cè)吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用GraphPad Prism v5.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)預(yù)防阿霉素所致小鼠心臟功能紊亂 與Con組比，Dox組小鼠心臟功能降低（P＜0.05）。與Dox組小鼠相比，運(yùn)動(dòng)可減輕阿霉素引起的心臟收縮和舒張功能的損害（P＜0.05）。見圖1。

圖1 運(yùn)動(dòng)對(duì)阿霉素心肌病小鼠心臟功能的影響

2.2 運(yùn)動(dòng)改善阿霉素所致小鼠心肌萎縮 與Con組比，Dox組小鼠平均心肌細(xì)胞橫截面積明顯減少（P＜0.05），2 個(gè)萎縮的基因標(biāo)志物Atrogin-1 及MuRF-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。與Dox組小鼠相比，運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著改善阿霉素導(dǎo)致的上述心肌萎縮指標(biāo)（P＜0.05）。見圖2。

圖2 運(yùn)動(dòng)改善阿霉素心肌病小鼠心肌萎縮

2.3 運(yùn)動(dòng)減少阿霉素誘導(dǎo)心肌病中HMGCS2的表達(dá)與Con組比，Dox組小鼠心臟中HMGCS2 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）。與Dox組小鼠相比，Exe組HMGCS2 mRNA和蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 運(yùn)動(dòng)對(duì)阿霉素心肌病小鼠心臟HMGCS2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.4 抑制HMGCS2增加阿霉素處理的心肌細(xì)胞生存細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素引起HL-1心肌細(xì)胞細(xì)胞活力降低（P＜0.05），細(xì)胞中HMGCS2表達(dá)增加、C-caspase-3/T-caspase-3比值增加（P＜0.05），而采用siRNA抑制HMGCS2表達(dá)后，可以提高心肌細(xì)胞活力（P＜0.05），C-caspase-3/T-caspase-3比值降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 抑制HMGCS2對(duì)阿霉素引起的心肌細(xì)胞活力和凋亡的的影響

3 討論

近年來，由于各類創(chuàng)新方法的研究，阿霉素的應(yīng)用得到進(jìn)一步維持和拓展。ZHOU等[11]發(fā)現(xiàn)將阿霉素結(jié)合CD133（肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志物）形成適體，靶向治療肝癌細(xì)胞，可以減少對(duì)其他細(xì)胞的傷害。負(fù)載阿霉素的膠束低分子量肝素-蝦青素納米顆粒，通過抑制中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophicle extracellular traps, NETs）的形成，能夠關(guān)閉炎癥前饋環(huán)和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，抑制肝轉(zhuǎn)移，抑制肺轉(zhuǎn)移，緩解腫瘤的炎癥和免疫抑制微環(huán)境，為乳腺癌及其肝、肺轉(zhuǎn)移提供了一種有希望的治療策略[12]。此外，功能納米顆粒還可以負(fù)載阿霉素與IL-2和干擾素-γ，利用增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，促進(jìn)阿霉素抗腫瘤作用[13]。同樣，阿霉素聯(lián)合miR-34a[14]和STAT3 siRNA[15]均能增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤效益。因此，阿霉素的應(yīng)用得到進(jìn)一步延續(xù)和拓展，其對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)機(jī)制仍值得進(jìn)一步研究。

長期使用阿霉素抗腫瘤導(dǎo)致心臟、腎臟等不良反應(yīng)，是限制阿霉素的主要因素。研究證實(shí)，即使沒有原發(fā)性心臟病，阿霉素作為化療藥物使用也會(huì)導(dǎo)致心功能不全[16]。在阿霉素急性小鼠模型中，降低炎癥應(yīng)答（例如IL-22敲除）有助于緩解心臟毒性，降低了血清和左心室組織中心肌損傷標(biāo)志物的表達(dá)，并改善心功能[17]。此外，減少氧化應(yīng)激也能降低阿霉素引起的心肌損傷[18]，例如小鼠NADPH氧化酶2缺陷，減少了超氧化物產(chǎn)生，可以消除阿霉素相關(guān)急性心臟損傷[19]。

除了傳統(tǒng)生理機(jī)制研究外，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，基因干預(yù)手段也被用于阿霉素相關(guān)心肌病研究領(lǐng)域。采用腺相關(guān)病毒實(shí)現(xiàn)心臟特異的miR-204過表達(dá)，可以抵抗注射阿霉素（15 mg/kg）導(dǎo)致的心肌損傷[18]。同樣，過表達(dá)miR-146a通過靶向TAF9b/P53途徑減少阿霉素引起的心肌凋亡，部分逆轉(zhuǎn)了阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[20]。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，中高劑量的阿霉素引起急性心臟功能降低。

藥理學(xué)方法和基因療法在臨床轉(zhuǎn)化方面，仍需要較長時(shí)間的安全性檢驗(yàn)。運(yùn)動(dòng)作為無創(chuàng)而安全的非藥理學(xué)治療方式，可以增強(qiáng)免疫功能，又能夠直接減緩各類心肌病的發(fā)生和發(fā)展[21-22]。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)干預(yù)減少了阿霉素所致心肌萎縮的發(fā)生，可能是改善心臟功能的重要機(jī)制。本研究結(jié)果提示，阿霉素化療之前，給予一定的運(yùn)動(dòng)康復(fù)方案，可能有助于減輕阿霉素引起的心血管不良事件，也可能更有利于癌癥患者整體康復(fù)。

然而，短期的運(yùn)動(dòng)并不能達(dá)到這些良好的護(hù)心效益，并且部分患者無法運(yùn)動(dòng)和不愿意運(yùn)動(dòng)。因此，研究運(yùn)動(dòng)保護(hù)阿霉素心肌病的機(jī)制尤為重要。運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的活性物質(zhì)，可以模擬運(yùn)動(dòng)效益，為阿霉素相關(guān)的心肌病藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)支持。在機(jī)制上，本研究還初步確定了運(yùn)動(dòng)可能通過抑制HMGCS2而發(fā)揮阻止阿霉素心肌病的作用。在本課題組之前的研究中也發(fā)現(xiàn)，HMGCS2在脂毒性心肌病小鼠心臟中表達(dá)增加，抑制HMGCS2后可以減少高濃度棕櫚酸引起的心肌細(xì)胞凋亡[9]。類似的，在非酒精性脂肪肝小鼠肝臟中，運(yùn)動(dòng)也可以減少HMGCS2的表達(dá)[10]，在肝細(xì)胞中抑制HMGCS2也能夠降低棕櫚酸引起的細(xì)胞凋亡[23]。在阿霉素引起的心肌萎縮和心功能降低過程中HMGCS2的作用仍未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，在阿霉素所致心肌萎縮過程中，增加的HMGCS2可能促進(jìn)β羥基丁酸等酮體中介產(chǎn)物形成，進(jìn)一步損害阿霉素心肌組織中心肌細(xì)胞代謝[24]。運(yùn)動(dòng)通過減少HMGCS2的表達(dá)而減少心肌細(xì)胞凋亡，最終有利于心臟功能保存。然而，HMGCS2保護(hù)阿霉素引起的心肌萎縮的分子作用仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

總之，在阿霉素所致心肌病小鼠中，運(yùn)動(dòng)通過抑制HMGCS2減少心肌細(xì)胞凋亡，從而改善心肌萎縮和心臟功能。