王莉，陸俊宏，林琦峻，谷美霖，屠文展，李盛村

1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 康復醫(yī)學中心，浙江 溫州 325027；2.浙江省針灸康復重點實驗室溫州市康復重點實驗室，浙江 溫州 325027

腦卒中是全球第二大死亡原因，僅次于缺血性心臟病[1-3]。即使沒有原發(fā)性心臟病，缺血性卒中后也可發(fā)生心肌損傷[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腦卒中28 d后，表現(xiàn)出心臟射血分數(shù)（ejection fraction, EF）顯著降低，心肌肥大、纖維化嚴重，以及心臟炎癥、浸潤巨噬細胞和氧化應激增加[6]。然而，另一研究指出，在腦卒中后短期內(nèi)心臟出現(xiàn)萎縮而非肥大，并且心肌萎縮持續(xù)到14 d與正常組比較仍存在顯著差異[7]。

耐力運動可引起心肌生理性肥厚，但不損害心臟功能，且研究發(fā)現(xiàn)堅持耐力運動的老年男性比無耐力運動習慣的同齡對照組有更好的心臟功能[8]。運動預處理是指在急性心腦血管事件發(fā)生之前開展的運動干預活動。運動預處理被證明能夠預防和緩解腦卒中、心肌梗死的嚴重程度[9-11]。腦卒中患者長期臥床導致心肌萎縮[12]，而運動預處理產(chǎn)生的生理性心肌肥厚有利于對抗病理性骨骼肌和心肌萎縮[13-14]。運動預處理的相關(guān)機制研究有助于開發(fā)“模擬運動保護效益”的藥物，有利于運動困難的腦卒中患者的康復。然而，運動預處理如何預防腦卒中后心肌損傷的機制仍不清楚。

Apelin是一種多肽類分子，能夠改善心肌梗死、血管緊張素誘導的心肌肥厚[15]，在肌少癥患者骨骼肌[16]和失重小鼠心肌[17]中表達降低。相反，運動能夠增加高血壓大鼠血管和心肌中Aplein和APJ mRNA表達[18]。類似的，有氧運動預處理也可能通過上調(diào)心肌APJ而改善心梗大鼠心肌纖維化、心肌細胞凋亡[19]。然而，Aplein及APJ參與運動保護腦卒中后心肌萎縮的作用機制鮮見報道。本研究擬探討運動預實驗調(diào)控Aplein及其受體APJ在預防腦卒中所致心肌萎縮和心功能降低中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：6～8周齡雄性C57BL/6小鼠購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物許可證號：SCXK（浙）2019-0001]，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物實驗室。保持恒溫20～22 ℃，每天接受12 h光照。所有小鼠自由進食飲水。

1.1.2 試劑與儀器：雙目體式顯微鏡購自深圳瑞沃德生命科技有限公司，用于大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）大腦中動脈梗死腦卒中模型。Vevo2100小動物超聲儀購自加拿大Visualsonics公司。TTC購自美國Sigma Aldrich公司。TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司。APJ一抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 運動預處理干預和造模及分組：實驗1：假手術(shù)對照組（Sham組）、腦梗死模型組（MCAO組），每組6只。實驗2：分為4組，每組6只，①假手術(shù)對照組（Sham組），靜養(yǎng)小鼠，進行沒有插入栓子的假手術(shù)操作；②運動對照組（Control組），小鼠執(zhí)行30 d運動方案并開展假手術(shù)操作；③腦梗死模型組（MCAO組），小鼠靜養(yǎng)，并按大腦中動脈栓塞手術(shù)執(zhí)行造模；④運動腦梗死模型組（Exercise組），小鼠執(zhí)行30 d運動方案，并按大腦中動脈栓塞手術(shù)執(zhí)行造模。運動預處理的小鼠按常規(guī)有氧運動方案執(zhí)行。具體而言，采用游泳運動進行預處理，將約30 ℃的水灌入塑料水箱中，水深15 cm迫使小鼠自愿游泳時后肢不能觸碰水箱底部，從而讓運動有效進行。第1周進行適應性訓練，從第2周開始游泳時間從10 min逐漸增加至40 min，保持40 min游泳30 d。運動強度參考文獻[20]并做修改，安排有氧運動強度為單次持續(xù)游泳達40 min[21]。運動方案結(jié)束1 d后，各組分別開展假手術(shù)和腦梗死造模手術(shù)。大腦中動脈閉塞腦梗死手術(shù)，栓子停留40 min，然后再灌注，4 d后取材。

1.2.2 腦梗死后神經(jīng)行為學測定：小鼠造模3 d后，清醒狀態(tài)下，對其進行Zea Longa 5分制評分。評分越高，小鼠神經(jīng)功能缺損越嚴重，按2～3分為模型建立成功標準。

1.2.3 小鼠心臟功能評價：模型組造模3 d后，將其用異氟烷麻醉并脫毛，超聲探頭獲取心尖四腔位，M模式下獲取心臟超聲影像，并計算心臟EF，短軸縮短率（fractional shortening, FS）和左心室舒張早晚期流速峰值比（E/A ratio, E/A比值）。

1.2.4 腦梗死面積評估：取小鼠腦組織后，將其放入-20 ℃冷凍20 min后切片2 mm厚度，放入預先加入TTC染液的6孔板中，37 ℃避光孵育20 min，每5 min翻動一下。正常腦組織呈鮮紅色，腦梗死部位呈白色。染色完畢加入4%多聚甲醛固定4～6 h。吸干腦組織表面液體后置于黑色背景板上，攝取圖片，并對白色區(qū)域進行統(tǒng)計。

1.2.5 心重脛骨長度比（HW/TL比值）和心肌細胞橫截面積評估：取出心臟后擠壓心腔內(nèi)血液并稱重，用尺子測量小鼠左腿脛骨長度，以心臟重量比脛骨長度獲得HW/TL比值。組織用4%多聚甲醛固定，自動脫水機脫水，包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，用WGA熒光染料染色1 h，含DAPI的防熒光猝滅封片劑封片。在奧林巴斯熒光顯微鏡下，攝取圖片，用ImageJ進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.2.6 心臟組織mRNA表達檢測：用TRIzol等提取和分離總RNA，分光光度計測定RNA濃度，評定RNA純度，利用試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，最后對樣本cDNA進行PCR定量。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.2.7 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測心臟組織蛋白表達：用適量裂解液、磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑等裂解組織，剪刀剪碎組織后勻漿，BCA法測定蛋白濃度，配好蛋白體系后，利用SDSPAGE凝膠電泳法使蛋白分離，再用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉，APJ（1:1 000，Proteintech,20341-1-AP）和GAPDH（1:5 000，Proteintech,10494-1-AP）一抗過夜，二抗孵育等步驟后，在化學發(fā)光凝膠成像儀（Biorad）中利用超敏ECL化學發(fā)光液使蛋白顯影。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 使用GraphPad Prism 5.0進行分析，計量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，兩組之間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死導致神經(jīng)行為學評分增加及心臟功能障礙 TTC染色結(jié)果顯示，腦梗死手術(shù)后，腦梗死引起大腦組織缺血，腦梗死面積顯著高于假手術(shù)對照組。在腦梗死小鼠模型成功且神經(jīng)行為學評分達到2～3分時，進行心臟超聲測定評估心臟功能，結(jié)果顯示，與Sham組相比，MCAO組小鼠腦梗死4 d后心臟收縮功能相關(guān)指標EF、FS及舒張功能指標E/A比值均明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 腦梗死手術(shù)對小鼠腦梗死面積、神經(jīng)行為學評分及心臟功能影響

2.2 運動預處理改善腦梗死小鼠心肌萎縮 與Sham組相比，MCAO組小鼠HW/TL比值顯著降低（P＜0.05），心肌細胞橫截面積也明顯減少（P＜0.05）。此外，與Sham組比，兩個萎縮的基因標志物Atrogin-1及MuRF-1的mRNA相對表達量在MCAO組中表達明顯增加（P＜0.05），而運動預處理干預可顯著降低上述心肌萎縮指標，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

A：HW/TL比值；B：WGA染色后統(tǒng)計平均心肌細胞橫截面積；C：Atrogin-1 mRNA相對表達量；D：MuRF-1 mRNA相對表達量。與Sham組比：aP＜0.05；與MCAO組比：bP ＜0.05。n=6

2.3 運動預處理改善腦梗死小鼠心臟功能 腦梗死可引起心臟收縮和舒張功能障礙。與Sham組比，MCAO組EF、FS以及E/A比值均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與MCAO組比，Exercise組EF、FS和E/A比值顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 運動對腦梗死小鼠心臟功能的影響

2.4 運動預處理上調(diào)腦梗死小鼠心肌中Apelin/APJ表達 與Sham組比較，MCAO組小鼠心臟中APJ蛋白表達量明顯下降（P＜0.05）。與MCAO組比，Exercise組APJ蛋白表達量增加（P＜0.05）。同樣的，MCAO組心肌中Apelin、APJ mRNA表達與Sham組比降低（P＜0.05），而運動預處理可以提高其表達（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。見圖4。

圖4 運動對腦梗死小鼠心肌中Apelin/APJ表達的影響

3 討論

實驗性腦卒中小鼠出現(xiàn)心臟功能降低和異常心肌重構(gòu)，其中最顯著的變化為急性心肌萎縮。運動預處理能夠促進心肌生長，形成生理性心肌肥厚，可以對抗病理性心肌重構(gòu)[22]。本研究采用運動預處理干預方式對抗腦卒中后心肌萎縮和心功能降低，并初步研究相關(guān)分子機制，為腦卒中患者精準靶向治療提供理論依據(jù)。

腦卒中28 d后，小鼠表現(xiàn)出心臟EF顯著降低、心肌肥大、纖維化嚴重、心臟炎癥、巨噬細胞浸潤和氧化應激增加[23]。然而，本研究結(jié)果表明MCAO 40 min再灌注模型建立4 d后小鼠表現(xiàn)出心肌萎縮和心功能降低。與本研究結(jié)果一致，VELTKAMP等[7]指出，與假手術(shù)組比較，腦梗后小鼠心臟表現(xiàn)為萎縮而非肥大，并且心肌萎縮持續(xù)到14 d。

臨床上存在急性缺血性卒中患者出現(xiàn)腦心綜合征的現(xiàn)象[24]。針對腦卒中后心肌損傷的治療，BIEBER等[23]發(fā)現(xiàn)采用美托洛爾處理可以抑制交感神經(jīng)信號而防止腦卒中后慢性心功能障礙的發(fā)展。此外，還有研究指出miR-126可以減少心肌纖維化而參與心-腦功能調(diào)節(jié)[25]，脾臟摘除術(shù)減少系統(tǒng)性炎癥反應也能夠改善腦卒中后心肌損傷[26]。然而，運動預處理形成心臟保護效益是加強生理性保護的途徑，可以減少藥物不良反應，但目前對運動預處理的研究仍不充分。

運動預處理除了預防腦卒中心肌病的發(fā)生外，其機制研究可能為腦卒中的整體后期康復和“模擬運動效益”的靶向藥物開發(fā)提供重要價值，特別適用于腦卒中、腦出血等運動困難患者的康復。運動預處理是無創(chuàng)的非藥理學康復手段，可以抵御心肌梗死、膿毒癥心肌病的發(fā)生和發(fā)展[27-28]，也可以減緩缺血性腦卒中的癥狀[29]。本研究結(jié)果表明，運動預處理確實很好地阻止了腦卒中心肌萎縮和心肌功能降低，運動誘導的生理性心肌肥大或生理性心肌生長是對抗腦卒中后病理性心肌萎縮的重要手段。

在機制上，本研究結(jié)果還表明運動預處理可能通過上調(diào)Apelin及其受體APJ而發(fā)揮對抗腦卒中心肌病的作用。Apelin和APJ存在于多種組織中，在心臟、肺和腫瘤中具有特殊地位，其中調(diào)節(jié)肽Apelin是孤兒G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體[30]。心衰大鼠心臟中表現(xiàn)出Apelin/APJ表達減少[31]。在微重力環(huán)境下，小鼠心肌中Apelin/APJ表達也下降[17]。這些結(jié)果表明，減少心臟中的力學刺激可以引起Apelin/APJ表達減少。相反，我們的結(jié)果證實，運動預處理是可以增加Apelin/APJ表達，而阻止腦卒中后心肌萎縮的發(fā)生。重要的是，模擬運動效益同樣可以發(fā)揮保護心臟的作用，例如LI等[31]研究表明外源性補充Apelin-13可以增加Apelin/APJ表達，改善糖尿病心肌病大鼠的心臟功能障礙和重塑。

本研究的不足之處為未能進一步驗證運動預處理是否依賴心肌細胞APJ而發(fā)揮阻止腦卒中后心肌萎縮的作用。在未來仍需要采用心肌細胞特異性敲除APJ而開展對應研究。

綜上所述，在腦卒中小鼠中，運動預處理可能通過上調(diào)Aplein/APJ表達，減少其心肌萎縮而改善心臟功能。Aplein和APJ可能是運動防治腦卒中心肌病重要的分子靶點。