王婷，鄒巖，李海燕，王永華

1.紹興市人民醫(yī)院 浙江大學紹興醫(yī)院 超聲科，浙江 紹興 312000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學 體育部，浙江 溫州 325035；4.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 康復科，浙江 溫州 325015

糖尿病發(fā)病率逐年升高，其對健康影響除了代謝紊亂外還在于導致嚴重的心血管并發(fā)癥。糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy, DCM）是一種獨立于冠心病、心臟瓣膜病和高血壓心臟病等之外的特異性心肌病，其病理表現為細胞凋亡和壞死增加、心肌細胞肥大、心肌膠原過度沉積，導致左心室舒張期和（或）收縮期功能障礙，與糖尿病患者心功能不全和高病死率密切相關[1]。諸多證據指出，長期適當的有氧運動療法可以降低糖尿病機體血脂和血糖，上調胰島素敏感性，減輕心肌細胞炎癥、凋亡程度和氧化應激反應水平，從而一定程度上延緩DCM的進展[2-5]。

近年研究發(fā)現，鐵死亡是一種新型的程序性細胞壞死方式，具有鐵依賴性，通過催化細胞膜高表達不飽和脂肪酸，促使脂質過氧化物積累從而損傷殺死細胞。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase-4, GPX4）是鐵死亡的重要調節(jié)劑，主要通過谷胱甘肽（glutathione, GSH）依賴的方式，還原有毒的過氧化物，從而保護線粒體和細胞免受鐵死亡損傷；而血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1,Hmox-1）的增加可加速血紅素降解，同時促進游離鐵的釋放，導致鐵死亡增加[6-8]。近年研究指出鐵死亡參與多種疾病如神經退行性疾病、炎癥、癌癥和缺血再灌注損傷[9]等的進展，同時也參與糖尿病諸多并發(fā)癥如腎病、腦血管疾病、視網膜病變和動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生發(fā)展[10]。據報道，鐵死亡激動劑可顯著降低心肌細胞GPX4的表達，引起鐵代謝異常和脂質過氧化[11]。LI等[12]研究結果表明GPX4可以抑制脂質過氧化負向調控鐵死亡，在DCM伴缺血/再灌注模型中，鐵死亡減少氧化應激反應和細胞凋亡損傷，顯著減輕糖尿病心肌梗死面積。

美國糖尿病學會鼓勵糖尿病患者進行適當運動用于改善心血管疾病等的并發(fā)癥。然而，有氧運動訓練是否調控心臟鐵死亡途徑來改善心臟功能尚不清楚。本研究通過對db/db自發(fā)糖尿病小鼠及高脂飲食（high fat food, HFD）聯合鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）誘導的2型糖尿病小鼠進行12周的跑臺運動干預，以闡明有氧運動介導心臟鐵死亡途徑這一新機制發(fā)揮其保護DCM的作用。

1 材料和方法

1.1 動物飼養(yǎng) 本研究遵循《實驗動物的護理和使用準則》（美國國家研究委員會）。8周齡雄性db/db小鼠、C57BL/6小鼠均從南京模式動物研究所購得。實驗期間所有小鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房。本研究采取的實驗方案已得到溫州醫(yī)科大學動物倫理委員會的批準（wydw2016-0266），實驗動物許可證號：SYXK（浙）2021-0017。

1.2 主要設備與試劑 ZS-PT小動物實驗跑臺購自北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)（Vevo 3100）購自加拿大Fujifilm VisualSonics 公司，血糖儀（艾科）購自杭州艾康生物技術有限公司。Hmox-1（ER1802-73）、GPX4（ET1706-45）、轉化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β,ER31210）、GAPDH（ET1601-4）抗體、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9, MMP9, ER1706-40）和肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain, MyHC,ET1702-88）抗體均購自杭州華安生物技術有限公司。4-HNE（MAB3249）抗體購自美國Bio-techne公司；心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP, sc-515701）和I型膠原蛋白（collagen-I,COL-I, sc293182）抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。STZ由美國Sigma公司提供；HFD購自北京博泰宏達生物技術有限公司。

1.3 動物飼養(yǎng)和分組 所有SPF級實驗小鼠均進行1周的適應性喂養(yǎng)。①普通飼料喂養(yǎng)db/db小鼠，構建成自發(fā)的2型糖尿病模型。將造模成功的小鼠隨機分成db/db糖尿病組（db/db組，n=8）和db/db糖尿病+運動組（db/db+EX組，n=8）。C57BL/6小鼠作為對照，隨機分成空白對照組（WT組，n=8）和單純運動組（EX組，n=8）。②STZ聯合HFD誘導的2型糖尿病小鼠模型。分別采用脂肪含量45%的飼料HD001（高脂組）和脂肪含量10%的普食飼料（對照組）喂養(yǎng)8周，然后以STZ[30 mg/（kg·d）]，共5 d；腹腔注射C57BL/6小鼠破壞胰島β細胞引起2型糖尿病。C57BL/6小鼠隨機分成空白對照組（WT組，n=8）和單純運動組（EX組，n=8）。HFD+STZ誘導的小鼠隨機HFD+STZ糖尿病組（HFD+STZ組，n=8）和HFD+STZ糖尿病+運動組（HFD+STZ+EX組，n=8）。

1.4 實驗運動方案 本研究參考FERNANDO等[13]的研究，使用小動物實驗跑臺，首先對造模所用小鼠進行為期1周的適應性訓練：設置坡度為0°，跑步速度為8 m/min，持續(xù)20 min/d，共5 d。對實驗小鼠分組后開始12周的正式訓練。運動組（db/db+EX組、EX組、HFD+STZ+EX組）：設置坡度為0°，速度為10 m/min，60 min/d，5 d/周。對照組（db/db組、WT組、HFD+STZ組）：將小鼠置于靜止的跑道上，不予額外刺激。跑臺運動干預在下午2:00—4:00進行。

1.5 無創(chuàng)超聲心動圖 提前剃去小鼠心前區(qū)毛發(fā)，充分暴露心前區(qū)，予異氟烷麻醉，保證小鼠心率在400～500次/min，使用高分辨率小動物超聲儀進行超聲心動圖掃描，檢測小鼠心臟結構和功能，采集M型和短軸超聲圖像，記錄心功能相關指標。

1.6 動物取材 實驗小鼠處死前12 h禁食，不控制其飲水量。在末次跑臺結束后24 h記錄小鼠體質量、血糖等指標，使用戊巴比妥鈉麻醉后充分暴露胸腔，切取部分心臟組織常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組化等染色檢測4-HNE表達，觀察心肌組織形態(tài)變化和纖維化，另留取部分心臟組織置于-80 ℃冰箱中備用，用于檢測心肌組織的相關指標。

1.7 HE染色、馬松染色和天狼星紅染色 心臟組織的石蠟切片先進行脫蠟脫水處理，再依次用蘇木素染液、伊紅染液對心肌組織進行HE染色；依次用飽和苦味酸和蘇木素對組織進行天狼星紅染色。馬松染色用新配置的Weigert鐵蘇木素染色液染色，分化反藍，麗春紅品紅染色，酸洗后放入苯胺藍染色液中染色。天狼星紅染色分析和馬松染色分析為計算膠原容積分數，分別為計算膠原陽性紅色面積或膠原陽性的藍色占總面積的百分比。

1.8 免疫組化 心臟石蠟切片脫蠟處理后置于枸櫞酸鈉緩沖液（pH=6.0，0.01 mol/L）中，用鐵飯盒或鍋煮沸，溫度控制在96～98 ℃，保持15 min，等自然冷卻后，漂洗干凈，用3%過氧化氫（80%甲醇稀釋）室溫孵育10 min，用于滅活內源酶活性。用PBS洗滌3 min/次，共3次。滴加一抗（4-HNE，1:100稀釋）充分覆蓋心臟組織，室溫孵育1 h后漂洗，滴加二抗（1:100稀釋）室溫孵育1 h，再次漂洗，滴加新配置的DAB顯色液，觀察組織顯色，及時終止，脫水封片。

1.9 Western blot檢測 剪碎心臟組織，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），充分勻漿，低溫高速離心得到上清液即為蛋白樣本。在凝膠樣本孔中加入20 μg樣本，進行電泳，使用Bio-Rad濕式轉膜，電流為300～600 mA，時間30～60 min。再用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗滌后加一抗（1%的BSA稀釋）置于4 ℃冰箱孵育過夜。再次洗滌后二抗室溫下孵育1 h。隨后加入顯色劑，曝光存照。使用軟件ImageJ 11.0分析條帶灰度值。以GAPDH為內參分別計算所測蛋白的相對表達量。

1.10 動物組織總RNA的提取與實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR） 取小鼠心臟組織置于冰上，依次用TRIzol、氯仿抽提RNA，高速離心取上層水相，沉淀洗滌倒置晾干，用適量DEPC水溶解，得到的溶液即為RNA，置于-80 ℃冰箱中待測。所用引物由上海生工生物工程有限公司制備。引物序列如表1所示，用2-ΔΔCt法分析mRNA的相對表達量。

表1 RT-qPCR相關引物的序列

1.1 1 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。用Shapiro-Wilk檢驗數據正態(tài)性，用Levene方差齊性檢驗判斷等方差性，正態(tài)分布計量資料采用±s表示，采用雙因素方差分析評價糖尿病和運動對心臟功能、心臟重構和心臟鐵死亡等的影響。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 有氧運動改善糖尿病小鼠心臟功能障礙 小鼠經胸無創(chuàng)性超聲心動圖檢查心臟功能發(fā)現，與WT組相比，db/db組小鼠舒張末左室后壁明顯增厚，心臟射血分數和左心室縮短分數明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與db/db組小鼠相比，db/db+EX組心肌肥厚減輕，心功能障礙得到顯著改善（P＜0.05），見圖1A、圖1B。在HFD+STZ誘導的2型糖尿病小鼠模型中我們觀察到這些指標具有相同的變化趨勢（P＜0.05），見圖1C、圖1D。可見，有規(guī)律的有氧運動可有效改善糖尿病小鼠的心功能障礙。

圖1 各組小鼠的心超圖及分析圖

2.2 有氧運動訓練緩解小鼠心臟纖維化和心臟肥大 小鼠心臟HE染色結果顯示，與對照組小鼠相比，單純EX組心臟組織無顯著變化，db/db組小鼠和HFD+STZ組小鼠心肌纖維粗大，排列明顯紊亂；運用馬松染色檢測各組小鼠心肌纖維化，db/db組小鼠和HFD+STZ組小鼠心臟組織可見更多的膠原和纖維組織的沉積，而db/db+EX組和HFD+STZ+EX組這些異常征象得到顯著改善，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。同樣地，Western blot檢測發(fā)現心肌纖維化分子標記物TGF-β、COL-1、MMP9和心肌肥大標記物指標MyHC、ANP在db/db組和HFD+STZ組小鼠心臟組織中表達顯著升高，而db/db+EX組和HFD+STZ+EX組明顯逆轉了這些指標變化，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在mRNA水平觀察到同樣的結果。見圖3和圖4。這些研究結果顯示有氧運動可以改善小鼠心臟纖維化、肥大，緩解糖尿病小鼠的心臟重構。

圖2 小鼠心肌組織HE和馬松、天狼星紅染色及統(tǒng)計分析圖

圖3 db/db自發(fā)糖尿病小鼠心肌組織肥大和纖維化指標的表達

圖4 HFD+STZ誘導小鼠模型的心肌肥大和纖維化相關的蛋白和mRNA的表達

2.3 有氧運動顯著增加了心臟組織鐵死亡指標GPX4的表達，減少了Hmox-1、4-HNE水平 與WT組相比，EX組心臟組織的Hmox-1和GPX4表達未見顯著變化，db/db小鼠心臟組織中鐵死亡指標GPX4表達顯著下降，Hmox-1表達顯著增加，相應地，在HFD+STZ誘導糖尿病小鼠中，心臟組織的Hmox-1和GPX4表達趨勢呈現一致的趨勢，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；心臟免疫組化結果同樣指出：糖尿病小鼠組心臟組織的4-HNE表達顯著增加，而有氧跑臺運動12周后小鼠心臟組織的Hmox-1和4-HNE表達量顯著下調，GPX4的水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。這些數據提示有氧運動顯著降低了糖尿病小鼠心臟組織鐵死亡水平。

圖5 小鼠心肌組織GPX4和Hmox-1的表達和4-HNE免疫組化結果

3 討論

糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，目前導致了嚴重的全球健康問題[14]，可因心肌細胞肥大，成纖維細胞增殖，細胞外基質過度沉積，或因心肌細胞死亡導致心肌質量減少，促使心肌順應性下降、心室重構等，最終導致心臟收縮和舒張障礙。既往研究指出：糖尿病大鼠心臟成纖維細胞的COL-I、IGF-1受體表達明顯增加，導致心臟膠原沉積明顯，而黃連素的處理能抑制COL-I和IGF-1受體有效緩解糖尿病誘導的心臟纖維化[15]。本研究同樣發(fā)現，自發(fā)糖尿病的db/db小鼠和高脂喂養(yǎng)聯合STZ誘導的糖尿病小鼠中，心臟組織TGF-β、COL-I上調，心肌纖維排列顯著紊亂，且伴隨相應的心臟舒張、收縮功能障礙，這些數據均表明糖尿病小鼠存在心肌重構，進而影響了心臟功能。

已明確心肌細胞死亡可導致心肌質量減少，細胞外基質合成和降解失衡，心肌順應性降低，心功能受損，是啟動DCM心臟病理重塑的關鍵步驟[16-17]，靶向抑制細胞死亡是有望成為今后減輕或逆轉心臟重構的治療或聯合治療的重要干預途徑。新近研究指出五味子乙素[18]、長編碼RNA-ZFAS1[19]或卡格列凈[20]等通過抑制鐵死亡途徑改善心肌氧化應激進而減輕糖尿病心肌損傷。已有研究表明，有氧運動時核因子E2相關因子2增加細胞核中GPX4的表達，抑制心肌鐵死亡的發(fā)生[21]。且Hmox-1在調節(jié)心血管功能起著重要作用，初步小樣本臨床數據指出Hmox-1基因多態(tài)性與次劑量運動后心臟反應參數改變具有一定的相關性[22]。本研究發(fā)現糖尿病小鼠的心臟組織鐵死亡指標Hmox-1表達顯著增加，而GPX4水平明顯下降，提示DCM中存在鐵死亡增加，而這些數據佐證了在DCM發(fā)生發(fā)展過程中，心臟鐵死亡促進心肌損傷這一環(huán)節(jié)扮演著重要角色，而靶向心肌鐵死亡也將可能成為DCM的新機制和防治的新策略。

諸多證據表明有氧運動可通過抗炎、減少凋亡或自噬等不同機制來緩解慢性病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[3，23]，通過改善線粒體功能[24]，降低ROS水平來保護心肌[25-27]，改善心肌功能。比如LEW等[26]研究指出，有氧運動能夠調節(jié)糖尿病小鼠心臟保護作用的重要效應因子miRNA-126，改善心肌微血管灌注，改善糖尿病心血管疾病的預后；運動通過調節(jié)胰島素樣生長因子1或磷脂酰肌醇3磷酸激酶水平[28]，抑制磷酸化組蛋白去乙?；?和上調葡萄糖轉運蛋白表達[29]等，影響心肌損傷反應中的增殖和修復機制。有規(guī)律的有氧運動可作為一種有效的干預手段，有助于防止或延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。本研究表明，與糖尿病組小鼠相比，糖尿病運動組小鼠心肌膠原纖維沉積顯著減少，心肌排列紊亂緩解，心肌重構改善，心功能也得到明顯提升。如前所述，DCM小鼠模型提示有氧運動通過調控Hmox-1與GPX4的水平，有效抑制DCM的心臟鐵死亡。除此之外，4-HNE作為與氧化應激密切相關的一種細胞活性醛，可通過線粒體涉及多種疾病的進展，如促使心肌細胞損傷，導致糖尿病介導的心力衰竭，因此，4-HNE可作為糖尿病心肌損害的生物標志物[30]。與此類似，本研究免疫組化結果顯示糖尿病心臟組織4-HNE水平明顯上調，而糖尿病運動組可有效降低心臟4-HNE的表達水平，提示有氧運動可通過調控心臟4-HNE減少脂質過氧化。

綜上所述，在DCM小鼠中，有氧運動降低心臟Hmox-1和4-HNE水平，促使GPX4表達增強，抑制了心臟鐵死亡，進而緩解心肌肥大及纖維化，減緩心室重構?？梢?，通過運動抑制心臟鐵死亡有望成為新的心臟保護靶點。