高上 滿淼淼 趙華 張麗娜 王加峰

摘要 ［目的］U-box蛋白是一類決定靶標蛋白特異性的E3泛素連接酶（少部分屬于泛素鏈聚集因子-E4），在植物抗病、抗逆和生長發(fā)育各階段都發(fā)揮著重要作用。為揭示U-box蛋白家族基因OsPUX2在水稻防御反應中的具體生物學功能，利用CRISPR/Cas9編輯技術對OsPUX2基因進行編輯。［方法］在OsPUX2第1外顯子設計1個20 bp的編輯靶點，構建了OsPUX2基因敲除載體pRGEB32-OsPUX2-gRNA載體，并通過農桿菌介導的轉化方法侵染水稻Pik-H4 NIL愈傷組織，經潮霉素檢測獲得轉基因陽性植株，并對T0代轉基因植株進行靶點區(qū)域序列進行PCR和測序分析，分析ospux2的突變類型。［結果］成功獲得了ospux2的敲除突變體材料，對突變類型的分析發(fā)現(xiàn)，轉基因編輯后代共存在7種突變類型，以缺失突變?yōu)橹鳎渲幸环N純合突變類型在OsPUX2第一個外顯子的第115號堿基處缺失了一個C堿基，導致蛋白的翻譯在第84個氨基酸處提前終止。［結論］該研究獲得ospux2突變株系對進一步研究該基因的功能具有重要意義。

關鍵詞 水稻；U-box；OsPUX2；CRISPR/Cas9；基因編輯

中圖分類號 S511 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2023）09-0073-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.018

Abstract ［Objective］Ubox proteins are a class of E3 ubiquitin ligases that determine the specificity of target proteins， play an important role in plant disease resistance， stress resistance and all stages of growth and development. In order to reveal the specific biological function of the Ubox protein family gene OsPUX2 in rice defense response， the OsPUX2 gene was edited by CRISPR/Cas9 editing technology. ［Method］A 20-bp editing target was designed in the first exon of OsPUX2 and the pRGEB32OsPUX2gRNA vector was constructed. Rice PikH4 NIL callus was infected by Agrobacteriummediated transformation and tested with hygromycin. The T0 generation transgenic plants were subjected to PCR and sequencing analysis of the target region sequence to analyze the mutation type of ospux2. ［Result］The knockout mutant of ospux2 was successfully obtained. There were a total of 7 mutation types in the transgenic edited progeny， which are mainly deletion mutations. One of the homozygous mutation types with a C base deletion at the +115 bp of the first exon of OsPUX2 gene leads to termination of protein translation at 84 aa. ［Conclusion］The ospux2 mutant strain obtained in this study is of great significance to further study the function of this gene.

Key words Rice；Ubox；OsPUX2；CRISPR/Cas9；Gene editing

基金項目 2021年省級鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略專項經費（2021KJ382）；農業(yè)農村部華南現(xiàn)代生物種業(yè)重點實驗室（2105-000000-20-03-457451）。

作者簡介 高上（1999—），男，河南鄭州人，碩士研究生，研究方向：水稻抗性。*通信作者，副研究員，博士，從事水稻病害研究。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細胞內蛋白質降解的重要途徑之一，參與生物體內絕大多數的生理活動，通過降解靶蛋白水平調控植物體的生長發(fā)育過程及其對生物脅迫和非生物脅迫的響應［1-2］。泛素-蛋白酶體系降解途徑由泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3及26S蛋白酶體組成，其中E1負責激活泛素，E2直接將泛素轉移到底物蛋白質，或者同泛素一起轉移給E3連接酶，形成被蛋白酶體識別的底物后被降解［3］。泛素分子對靶蛋白的特異性識別主要依賴于E3泛素連接酶，E3是一個大的、多樣化的蛋白群，根據基序的不同，可分為4類：HECT結構域、U-box結構域、RING-finger結構域、Cullin-RING結構域［4-5］。其中U-box蛋白質廣泛存在于酵母到人類的大量真核生物中［6］。據報道，植物中U-box蛋白質在抵抗生物脅迫與非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用［3］，迄今為止，大部分水稻U-box蛋白質的功能及其作用機制尚不清楚，通過利用基因編輯技術對靶基因OsPUX2進行定點編輯，為解析該類蛋白質在植物抗病抗逆方面的功能具有重要意義。

目前已經有大量U-box蛋白質參與抗病抗逆過程的報道，如在植物抗病反應中起負調控作用的AtSPL11、AtPUB12/AtPUB13［7-9］及在植物抗病中發(fā)揮著正調控作用的CMPG1、AtPUB17等［10-11］。水稻OsPUB44正調控水稻PTI及其對白葉枯病的抗性［12］。AtPUB22和AtPUB23能夠協(xié)同負調控植物的干旱脅迫反應，而AtPUB30蛋白能調控植物耐鹽作用［13］。此外，水稻OsPUB15能夠降低活性氧暴發(fā)，從而正調控鹽脅迫反應［14］。AtPUX1對于清除無功能的AtCDC48具有重要作用，可介導多種細胞活動，包括內質網和高爾基體膜的同型融合、內質網相關蛋白降解、細胞周期進程和細胞凋亡［15］。雖然大量U-box蛋白參與調控植物各種生理活動被研究報道，植物許多U-box蛋白的功能及其作用機制研究也取得了較大進展，但仍缺乏系統(tǒng)深入研究。水稻中OsPUX2與AtPUX2親緣關系較近，但其具體功能尚不清楚。

CRISPR/Cas9技術作為一種高效的基因編輯工具，已經被廣泛應用于水稻、小麥、玉米、番茄等農作物中，實現(xiàn)對不同靶基因的定向編輯，在分子育種方面也顯示了巨大的應用潛力［16-18］。CRISPR/Cas9介導的基因編輯是由gRNA與Cas9蛋白組成復合物實現(xiàn)的，gRNA負責定位與其有互補關系的DNA雙鏈，Cas9核酸酶負責切割DNA雙鏈產生雙鏈斷裂（Double strand breaking，DSB），經非同源末端連接修復（nonhomologous endjoining，NHEJ）后，產生一系列插入、缺失及堿基替換突變，從而創(chuàng)造出一系列的突變體，以便于進行基因功能的研究。由于CRISPR/Cas9 技術操作簡單，效率較高，目前已被廣泛應用于各類生物基因功能研究中［19］。

筆者利用CRISPR/Cas9基因編輯技術定點編輯水稻OsPUX2基因，構建水稻OsPUX2的突變體材料，以期為后續(xù)開展OsPUX2參與的具體調控通路的功能解析奠定重要的材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以粳稻Pik-H4 NIL為受體材料。 Cas9-gRNA表達載體pRGEB32購自Addgene。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105由本實驗室保存。

1.2 靶點的選擇及gRNA設計

利用CRISPR/Cas9靶位點在線設計平臺（http：//skl.scau.edu.cn/）［20］設計OsPUX2編輯靶點，查找符合GN19NGG的序列。其中，GN19為20個堿基的靶點序列，NGG（N表示任意堿基）為識別靶序列的原初間隔序列毗鄰基序（Protospacer adjacent motif，PAM）。優(yōu)選靶位點位于編碼序列5′端，與潛在脫靶位點的差異在3個堿基以上，以保證編輯的特異性。選擇第1外顯子設計1個20 bp的編輯靶點，設計2條互補靶點引物OsPUX2-E1gRNAF與OsPUX2-E1gRNAR，其靶點引物序列分別為TGCAGATGATCCGTGGCAAGATGCCAAGGGGACTCGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAG（5′—3′）和CTATTTCTAGCTCTAAAACGGCGAGTCCCCTTGGCATCTTGCCACGGATCATCTGCA（5′—3′）。靶位點的特異性通過水稻全基因組BLAST分析進行比對。

1.3 CRISPR/Cas9表達載體構建

首先將Cas9蛋白表達載體pRGEB32用BsaI進行單酶切，凝膠回收載體片段，將2條互補靶點引物OsPUX2-E1gRNAF與OsPUX2-E1gRNAR進行退火反應，將其與凝膠回收的pRGEB32載體片段利用重組酶進行重組連接反應（反應體系：4 μL 5×CE Ⅱ Buffer、2 μL Exnase Ⅱ、0.03 pmol pRGEB32、0.06 pmol 插入片段，補ddH2O至20 μL；37 ℃ 30 min），將連接產物轉化大腸桿菌DH5α后對靶點序列利用U3gRNA-F與UBI-R（表2）進行菌落PCR鑒定，并進行測序分析，取測序正確的重組質粒轉化農桿菌EHA105感受態(tài)，并侵染轉化Pik-H4 NIL愈傷組織，經潮霉素篩選獲得再生T0代植株。用CTAB法提取植株葉片基因組DNA，利用OsPUX2-kotest-F與OsPUX2-kotest-R（表2）對靶位點區(qū)域DNA片段進行PCR擴增（產物約408 bp）鑒定突變類型。引物U3gRNA-F、UBI-R、OsPUX2-kotest-F、OsPUX2-kotest-R 的堿基序列分別為GTTGGAAACCACGTGATGT（5′—3′）、ACTGTAATTTCTTCTGGCTGG（5′—3′）、ACAACAGGCAAATCAGGAGC（5′—3′）、GGAACGACAAGTACAGGAAGG（5′—3′）。

2 結果與分析

2.1 gRNA靶點選擇和序列設計

OsPUX2含有3個外顯子，CDS含有615個堿基，編碼205個氨基酸（aa），UBX結構域位于OsPUX2的C端區(qū)域（121～205 aa）。為完全破壞OsPUX2基因的功能，利用CRISPR/Cas9靶位點在線設計平臺（http：//skl.scau.edu.cn/）在OsPUX2第1個外顯子區(qū)域選擇一個靶點（5′—AGATGCCAAGGGGACTCGCC CGG—3′）進行定點編輯，靶位點位于編碼區(qū)+98到+118處（圖 1）。將設計的靶位點序列進行BLAST比對分析，證明其具有較好的特異性。

2.2 OsPUX2基因的CRISPR/Cas9表達載體構建

首先凝膠回收BsaI酶切后的pRGEB32載體片段，將2條互補靶點引物OsPUX2-E1gRNAF與OsPUX2-E1gRNAR退火后直接將其與BsaI酶切后的pRGEB32載體片段利用重組酶進行重組連接反應，重組產物熱激轉化后，挑取單克隆用引物U3gRNA-F、UBI-R進行菌落PCR擴增，得到500 bp的目的條帶（圖2）。對陽性菌落質粒利用U3gRNA-F進行測序，結果表明OsPUX2基因的1個靶點序列克隆至pRGEB32載體，成功獲得pRGEB32-OsPUX2-gRNA的表達載體，可以進行后續(xù)轉基因試驗。

2.3 OsPUX2基因的CRISPR/Cas9轉基因植株鑒定

pRGEB32-OsPUX2-gRNA的表達載體轉入農桿菌EHA105中，利用農桿菌介導法將表達載體轉入水稻材料Pik-H4 NIL愈傷組織中，經過加有潮霉素的培養(yǎng)基篩選后，將陽性愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基；進一步生根培養(yǎng)得到T0代OsPUX2基因的CRISPR/Cas9轉基因植株。最終獲得20個潮霉素陽性轉基因植株（圖3）。

2.4 編輯突變體的突變類型分析

首先利用引物（OsPUX2-kotest-F與OsPUX2-kotest-R）對潮霉素基因檢測為陽性的植株OsPUX2編輯靶點區(qū)域DNA片段進行擴增。電泳結果表明，所有的CRISPR/Cas9編輯突變體都能擴增出408 bp左右的目的條帶（圖4）。對相應突變體靶位點區(qū)域的DNA片段進行測序，并以野生型序列作為參考，對OsPUX2轉基因株系中各靶位點序列進行比較，并利用解碼網站（http：∥skl.scau.edu.cn/dsdecode/）對全部轉基因植株進行序列分析。結果表明（圖5），ospux2的突變頻率高達85%，共存在7種突變類型，多為剪切位點處產生的堿基缺失突變，分別有-1、-2、-4、-5、-23、-23及-2/+1（缺失/插入）類型，分別占編輯類型總數的51.7%、10.3%、10.3%、13.7%、3.4%、6.9%和3.4%，其中，單堿基缺失占比最高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，含有單堿基缺失（CDS中115號堿基C缺失）的突變體有6個轉基因株系均為純合缺失突變（ospux2-1、ospux2-2、ospux2-11、ospux2-19、ospux2-21和ospux2-25），該堿基缺失導致該蛋白的翻譯在第84個氨基酸處提前終止。綜上分析可以發(fā)現(xiàn)，成功實現(xiàn)了對OsPUX2基因的定點編輯，并獲得了6株含有1個堿基的純合突變株系，而雜合突變株系需要在T1、T2代繼續(xù)與測序進行比較分析。

3 討論

CRISPR/Cas9是一項比TALEN和ZFN技術優(yōu)勢更強的基因編輯技術，能夠精確地對植物基因組的靶標部位進行編輯，具有較高的特異性和編輯效率。CRISPR/Cas9技術的出現(xiàn)為植物基因工程研究提供了新工具，也極大推動了植物中復雜調控網絡的解析與遺傳育種研究。

U-box蛋白質多參與植物的生長發(fā)育、生物脅迫與非生物脅迫過程的調控［9，12-13］。前期研究發(fā)現(xiàn)，OsPUX2基因可能參與對稻瘟病抗性的調控，經分析發(fā)現(xiàn)，OsPUX2基因與擬南芥的AtPUX2同源性高，但具體的功能仍不清楚。為進一步研究OsPUX2基因在抗病途徑中的功能，該研究利用單靶點gRNA對水稻的OsPUX2基因進行了定點編輯，獲得了一系列不同缺失類型的ospux2突變體，ospux2的突變頻率高達85%，其中，ospux2單堿基缺失突變類型占51.7%，該堿基（115號堿基C）缺失導致蛋白翻譯提前終止，突變株系中有6株含有該種類型的純合突變。其他類型的突變包括多堿基缺失及插入株系都處于雜合狀態(tài)，需要在T1代或T2代予以分離出來，這些類型的突變中除3堿基缺失會造成整碼突變外，其他多造成蛋白翻譯的提前終止。以上功能缺失型突變體的獲得為進一步研究OsPUX2基因的功能提供了重要的遺傳材料。

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