艾 鑫，敬隆鑫，趙文君，律鳳霞，賈健輝

（牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

灰樹花（Grifola frondosa），又名貝葉多孔菌、舞茸等，屬于真菌門（Eumycota）擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）無隔擔(dān)子菌亞綱（Polyporales）非褶菌目（Aphyllophorales）多孔菌科（Polyporaceae）樹花菌屬（Grifola）[1-2]?；覙浠橹袦匦?、喜光、好氧的木腐菌，子實體由菌柄和菌蓋疊生而成，菌肉白色，菌管延生；孢子卵圓形至橢圓形，無色、光滑；其味如雞絲，脆如玉蘭，享有“食用菌王子”和“華北人參”的稱號，在全球菌類中產(chǎn)量排名較為靠前[3-6]。灰樹花的蛋白質(zhì)含量高達(dá)31.5%，必需氨基酸含量占總氨基酸的45.5%，遠(yuǎn)高于香菇（Lentinus edodes）、銀耳（Tremella fuciformis）、黑木耳（Auricularia auricula）等常見食用菌[7-9]。此外還富含糖類、萜類、酸類等物質(zhì)，因此具有多種生理功能，如所含的多糖具有抑制腫瘤、與其他物質(zhì)協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡、降低血糖、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟、抑制艾滋病病毒增殖、減輕艾滋病相應(yīng)癥狀、抗病毒、抗氧化、抗輻射、調(diào)節(jié)血脂、降血壓等作用[10-23]。

己糖轉(zhuǎn)運蛋白（HXT2）屬于易化子超級家族MFS（major facilitator superfamily），是一種膜結(jié)合蛋白分子，具有12 個跨膜結(jié)構(gòu)域，氨基端和羧基端各有6 個跨膜區(qū)，其具有很高的同源性[24-26]。己糖轉(zhuǎn)運蛋白還是一種重要的糖載體蛋白，主要功能是己糖的攝取和己糖由胞外向胞內(nèi)的運輸[27]。作為一種高親和、低承載的己糖轉(zhuǎn)運體，HXT2 蛋白可影響宿主糖的攝取、代謝和基因表達(dá)，主要在葡萄糖、半乳糖、果糖等糖的轉(zhuǎn)運中起作用[28-30]。

通過以灰樹花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為依據(jù)，篩選灰樹花己糖轉(zhuǎn)運蛋白（GfHXT2）的cDNA 序列，并利用生物信息學(xué)方法，對該蛋白的理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽、結(jié)構(gòu)特征、蛋白修飾位點和蛋白交互網(wǎng)絡(luò)等方面進(jìn)行預(yù)測和分析[31]，以期為灰樹花己糖轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

灰樹花樣品來自牡丹江師范學(xué)院生物實驗室。

1.1.2 試驗設(shè)備

ST16R 高速冷凍離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司；PTC200 熱循環(huán)儀，美國MJ 公司；UV-1700紫外分光光度儀，上海奧析科學(xué)儀器有限公司；A100 型全觸控屏PCR 儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；DZKW-4 水浴鍋，北京恒奧德科技有限公司；FA1604 電子分析天平，賽輪儀器；YY-16D 電泳儀，杭州諾丁科學(xué)器材有限公司；恒溫培養(yǎng)箱BLC-25-II，北京陸希科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰樹花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取

提取灰樹花總RNA，基于SBS（sequencing by synthesis，SBS）技術(shù)，以IIIumina Hiseq 高通量平臺對RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾、重建形成轉(zhuǎn)錄組Unigenes。

1.2.2 灰樹花己糖轉(zhuǎn)運蛋白生物信息學(xué)分析軟件

用于進(jìn)行灰樹花己糖轉(zhuǎn)運蛋白（GfHXT2）生物信息學(xué)分析的軟件信息詳見表1。

表1 生物信息學(xué)分析工具Tab.1 Bioinformatics analysis tools

利用如表1世紀(jì)的軟件，對GfHXT2 蛋白的理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽、亞細(xì)胞定位、跨膜螺旋結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、蛋白修飾位點和蛋白交互網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果

用ProtParam 軟件對GfHXT2 對應(yīng)的基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該基因全長為1 871 bp，編碼區(qū)（CDS）為304～1 446 bp，共編碼380 個氨基酸。分子式為C2434H3764N622O670S14，相對分子質(zhì)量為52 909.27，總原子數(shù)為7 504，理論等電點（pI）為6.27，堿性氨基酸總數(shù)（Arg+Lys）為36，酸性氨基酸總數(shù)（Asp+Glu）為39，親水性平均水平為0.286。不穩(wěn)定指數(shù)（instabilityindex，Ⅱ）為31.56，說明GfHXT2 蛋白較為穩(wěn)定。該蛋白的氨基酸組成情況詳見圖1。

圖1 GfHXT2 蛋白質(zhì)的氨基酸組成Fig.1 Amino acid composition of GfHXT2 protein

如圖1世紀(jì)，GfHXT2 蛋白包含20 種氨基酸，其中亮氨酸占11.2%，甘氨酸占10.2%，異亮氨酸占8.1%，絲氨酸占7.5%，丙氨酸占7.3%，纈氨酸占7.1%，蘇氨酸占6.2%，苯丙氨酸占5.8%，精氨酸和谷氨酸均占5%，脯氨酸占4.8%，天冬氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸均占3.1%，天冬酰胺占2.9%，賴氨酸、蛋氨酸以及色氨酸均占2.5%，組氨酸占1.7%，半胱氨酸含量最少僅占0.4%。

2.2 GfHXT2 蛋白的親/疏水性預(yù)測結(jié)果

用ProtScale 軟件對GfHXT2 蛋白的親/疏水性進(jìn)行預(yù)測，詳細(xì)情況見圖2。

圖2 蛋白親/疏水性分析Fig.2 Protein hydrophilicity and hydrophobicity analysis

如圖2世紀(jì)，GfHXT2 蛋白的整個肽鏈中均含有親水性或疏水性的氨基酸，在第410 和第411 氨基酸處得分最高，為3.056；在第461 氨基酸處得分最低，為-2.678。通過蛋白質(zhì)親水和疏水的得分，結(jié)合理化性質(zhì)分析結(jié)果，判斷GfHXT2 蛋白為結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定的親水蛋白。

2.3 GfHXT2 蛋白信號肽預(yù)測及亞細(xì)胞定位分析結(jié)果

信號肽在重組蛋白的轉(zhuǎn)運和分泌方面作用顯著，具有介導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、平衡蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運和翻譯速度的功能，一般位于蛋白質(zhì)的N 端，長約5～30 個氨基酸，包含信號肽的C 端、N 端和疏水核心區(qū)[32-33]。通過SignalP 5.0 軟件，依據(jù)剪切位置前的信號肽分值高來預(yù)測GfHXT2 蛋白的氨基酸序列中是否存在潛在的信號肽剪切位點，檢測結(jié)果詳見圖3。

圖3 GfHXT2 蛋白保守序列分析Fig.3 Conserved sequence analysis of GfHXT2 protein

如圖3世紀(jì)，信號肽分值（signal peptide score）為0.002 4，因此判斷GfHXT2 蛋白不含信號肽。通過PSORTⅡserver 軟件對GfHXT2 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明其分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的概率為55.6%，分布在分泌系統(tǒng)囊泡、高爾基體、線粒體和液泡的概率均為11.1%。

2.4 GfHXT2 蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

含有跨膜域的蛋白質(zhì)可能是定位于膜的蛋白或者離子通道蛋白，也可能是膜受體蛋白?？赏ㄟ^在線軟件TMHMM，將測到的跨膜區(qū)以紅色標(biāo)出，并預(yù)測出具體的位置，預(yù)測結(jié)果詳見圖4。

圖4 GfHXT2 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Transmembrane domain prediction of GfHXT2 protein

如圖4世紀(jì)，紫色矩形為跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，藍(lán)色線段是膜內(nèi)結(jié)構(gòu)，黃色線段是位于膜外的結(jié)構(gòu)。GfHXT2 蛋白包含481 個氨基酸，跨膜螺旋殘基數(shù)量的期望值約為212.62，說明可能含跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，N-term 位于膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的總概率為58.7%。通過TMHMM 2.0 程序預(yù)測出10 個跨膜螺旋區(qū)，位置分別在第25～44、第54～76、第83～101、第111～130、第134～165、第268～290、第297～319、第343～365、第377～399、第403～425 氨基酸上。

2.5 GfHXT2 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果

通過NCBI-CDD 軟件對GfHXT2 蛋白的保守序列及蛋白家族進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果詳見圖5。

圖5 GfHXT2 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 Conserved domain prediction of GfHXT2 protein

由圖5 可知，GfHXT2 屬于MFS 基因家族的HXT 亞家族，且都具有相似的結(jié)構(gòu)[34]。第172～230氨基酸之間的區(qū)域為HXT 家族的保守結(jié)構(gòu)域。

2.6 GfHXT2 蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

用SOPMA 對GfHXT2 的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果詳見圖6。

圖6 GfHXT2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Secondary structure prediction of GfHXT2 protein

由圖6 可知，GfHXT2 蛋白由481 個氨基酸組成，包含4 種形態(tài)，分別為α 螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β 轉(zhuǎn)角。其中有205 個氨基酸可能會形成α 螺旋（alpha helix），占42.62%；157 個氨基酸可能形成無規(guī)則卷曲（random coil），占32.64%；96 個氨基酸可能形成延伸鏈（extended strand），占19.96%；23 個氨基酸可能形成β 轉(zhuǎn)角（beta turn），占4.78%。無二硫鍵的形成，沒有特殊的二級結(jié)構(gòu)。

利用SWISS-MODEL 對GfHXT2 蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和模型構(gòu)建，結(jié)果詳見圖7。

圖7 GfHXT2 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Tertiary structure prediction of GfHXT2 protein

由圖7 可知，GfHXT2 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致，α 螺旋可能形成無規(guī)則卷曲。

2.7 蛋白修飾位點的預(yù)測結(jié)果

通過NetNGlyc 1.0 Server 軟件對GfHXT2 的N端糖基化位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果詳見圖8。

圖8 GfHXT2 蛋白的N 端糖基化位點Fig.8 N-terminal glycosylation site of GfHXT2 protein

由圖8 可知，GfHXT2 蛋白共存在4 個N 端糖基化位點，分別位于第31、第96、第260、第369氨基酸位置處。通過NetOGlyc 4.0 Server 平臺對GfHXT2 的O 糖基化位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示其含有3 個O 端糖基化位點，分別位于第22、第26、第108 氨基酸處。

2.8 GfHXT2 蛋白絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸位點的預(yù)測結(jié)果

使用NetPhos 3.1 Server 平臺對GfHXT2 蛋白的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果詳見圖9。

圖9 GfHXT2 蛋白絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸位點Fig.9 Serine,threonine and tyrosine phosphate sites of GfHXT2 protein

由圖9 可知，3 種氨基酸共有磷酸化位點44個，其中絲氨酸（Serine）有27 個磷酸位點，分別在第19、20、21、24、28、45、53、58、74、127、142、159、167、178、224、267、279、298、337、352、354、393、401、433、443、456、467 氨基酸處；蘇氨酸（Threonine）有17 個磷酸位點，分別在第44、65、69、71、134、174、218、233、257、264、265、283、301、326、332、390、452 氨基酸處；不含有酪氨酸（Tyrosine）磷酸位點。根據(jù)上文可知，GfHXT2 蛋白較為穩(wěn)定，說明絲氨酸的27 個磷酸化位點可以提高該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[35]。

2.9 蛋白交互網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

通過STRING 對蛋白進(jìn)行交互網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果詳見圖10。亞單位β-2（SIP2）、含WD 重復(fù)序列的蛋白（mip1）、非特征蛋白質(zhì)（A0A1C7M1M4）、5'-腺苷酸激活的蛋白激酶亞單位γ（cbs2）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（ATG1）、含DUF1752 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（A0A1C7MAL7）、PHO 系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)器（PHO85）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（ssp1）和cAMP 依賴性蛋白激酶調(diào)節(jié)亞單位（PKAR）。存在48 條互作關(guān)系，線段表示互相物理接觸或在功能上有關(guān)的蛋白質(zhì)通過復(fù)雜的相互作用連接[36]。

圖10 GfHXT2 蛋白交互網(wǎng)絡(luò)分析Fig.10 Analysis of GfHXT2 proteininteractive network

3 結(jié)論與討論

如圖10世紀(jì)，線段的顏色表示互作類型，線條粗細(xì)表示互作的強(qiáng)度。結(jié)果顯示有13 個蛋白質(zhì)與GfHXT2 蛋白互作，即：非特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（SNF1）、高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（ght2）、推測的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（rco-3_1）、SNF1 蛋白激酶

HXT 亞家族屬于膜轉(zhuǎn)運蛋白主要促進(jìn)劑超家族（MFS）。MFS 蛋白被認(rèn)為是通過1 個單一的底物結(jié)合位點發(fā)揮作用，交替進(jìn)入機(jī)制涉及搖桿開關(guān)類型的運動。真菌己糖轉(zhuǎn)運蛋白（HXT）亞家族由功能冗余蛋白質(zhì)組成，主要在葡萄糖、半乳糖、果糖等的轉(zhuǎn)運中起作用。而灰樹花具有多種生理功能，其主要生物活性成分是多糖類物質(zhì)。因此研究己糖轉(zhuǎn)運蛋白HXT2 具有較高的生物學(xué)價值，可以通過改變編碼HXT2 的基因影響葡萄糖、半乳糖、果糖等糖的轉(zhuǎn)運，進(jìn)而改變灰樹花多糖含量，以期提高灰樹花多糖的生物學(xué)功能。

目前對于食用菌的研究主要集中在多糖的生物學(xué)功能和藥用價值方面，針對灰樹花己糖轉(zhuǎn)運蛋白方面的研究較少。有研究結(jié)果表明HXT2 是中度親和的轉(zhuǎn)運子，易被低濃度葡萄糖誘導(dǎo)，而被高濃度葡萄糖所抑制[37-38]。HXT2 的編碼基因敲除試驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵的起始時間延遲，這意味著HXT2 在調(diào)節(jié)生長起始過程中發(fā)揮作用[39]。因此后續(xù)可以通過在實驗室進(jìn)行高親和力轉(zhuǎn)運子基因克隆，使具有己糖運輸能力的基因高效表達(dá)。