李艷婷，郭 尚**，馮 斌，徐莉娜，郭霄飛，郭偉偉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西 太原 030031；2.山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西 太原 030000）

大白樁菇（Leucopaxillus giganteus）屬擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）傘菌目（Agricales）白蘑科（Tricholomataceae）白樁菇屬（Leucopaxillus），又名雷蘑、大青蘑[1]。子實(shí)體大型，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，還可治療小兒麻疹、煩燥不安等病癥[2-3]。此外，大白樁菇含有多糖、杯傘素等生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)具有清除過(guò)量自由基、提高免疫力、抗腫瘤等生物學(xué)功能[4-7]。已有研究測(cè)定大白樁菇子實(shí)體蛋白質(zhì)含量為49.12 g·100-1·g-1，17 種游離氨基酸總量為33.95 g·100-1·g-1，其中必需氨基酸占比31.41%（色氨酸除外），不僅富含鮮味成分天冬氨酸和谷氨酸，且氨基酸評(píng)分（35.26）高于FAO/WHO模式的35%，所以大白樁菇具有較好的口感和風(fēng)味，極具研究?jī)r(jià)值[8]。

大白樁菇作為臺(tái)蘑的代表種類(lèi)之一，目前對(duì)其蛋白質(zhì)與水解氨基酸的相關(guān)研究卻尚屬空白[9]。為深入研究大白樁菇中蛋白質(zhì)與氨基酸的生物活性，首先要建立氨基酸含量的測(cè)定方法。試驗(yàn)首次對(duì)大白樁菇中的水解氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行了方法學(xué)研究，并通過(guò)水解氨基酸含量對(duì)大白樁菇的蛋白質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

大白樁菇采集于山西呂梁地區(qū)。該地區(qū)海拔為2 249.90 m，位于東經(jīng)111°51′36″、北緯38°46′12″處，為針闊葉林和混交林地生長(zhǎng)地帶。子實(shí)體保藏于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，標(biāo)本編號(hào)為SXSYJBB1601。

1.2 主要試劑

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，塞卡姆（北京）科學(xué)儀器有限公司；濃鹽酸（優(yōu)級(jí)純），太倉(cāng)滬試劑有限公司；苯酚，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氨基酸測(cè)定成品試劑包（緩沖液A、緩沖液B、緩沖液D、鉀鈉緩沖液、茚三酮、檸檬酸鈉緩沖液），塞卡姆（北京）科學(xué)儀器有限公司。

1.3 主要儀器

S-433D 型全自動(dòng)氨基酸分析儀，塞卡姆科學(xué)儀器有限公司；TVE-1100 試管濃縮儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；水浴氮吹儀器，上海那艾精密儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 大白樁菇樣品制備

參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》（GB 5009.124-2016）[10]的方法并對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)后處理樣品。

將大白樁菇子實(shí)體洗凈，50 ℃烘箱放置24 h，粉碎，過(guò)60 目篩，備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取50 mg 樣品于20 mL 水解管中，加入6 mol·L-1的鹽酸10 mL，加入3 滴新蒸餾的苯酚，充入高純氮?dú)夂髷Q緊螺絲蓋。將已封口的水解管置于110 ℃電熱鼓風(fēng)恒溫箱中水解22 h，取出，冷卻至室溫。打開(kāi)水解管，水解液過(guò)0.45 μm 濾膜，純水沖洗水解管2～3 次，水洗液均過(guò)0.45 μm 濾膜，并全部轉(zhuǎn)移至同一個(gè)50 mL 容量瓶?jī)?nèi)，去離子水定容，振蕩混勻。

準(zhǔn)確吸取1.0 mL 濾液，移入20 mL 蒸干管，使用試管濃縮儀在50 ℃環(huán)境下減壓干燥，殘留物用2.0 mL 去離子水溶解，再減壓干燥，最后蒸干。將2.0 mL 檸檬酸鈉緩沖液加入到干燥后蒸干管內(nèi)溶解底物，振蕩混勻后，吸取溶液過(guò)0.22 μm 濾膜，轉(zhuǎn)移至儀器進(jìn)樣瓶，為樣品測(cè)定液，供儀器測(cè)定用。

1.4.2 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（濃度500 μmol·L-1）的制備：精密量取2 mL 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為2.5 mmol·L-1），轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用pH 2.2 的樣品稀釋液（檸檬酸鈉緩沖液）定容至刻度。

精密量取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.02、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用pH 2.2 的樣品稀釋液（檸檬酸鈉緩沖液）定容至刻度，搖勻，得濃度為1.0、5.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 μmol·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.4.3 測(cè)定條件

色譜柱編號(hào)為0208167；柱溫為58 ℃；反應(yīng)器溫度為130 ℃；流速為0.25 mL·min-1；進(jìn)樣量為50 μL。

1.4.4 水解氨基酸及蛋白質(zhì)評(píng)價(jià)

氨基酸成分分析評(píng)價(jià)根據(jù)氨基酸測(cè)定數(shù)據(jù)，計(jì)算大白樁菇子實(shí)體蛋白質(zhì)的必需氨基酸組成，參考FAO/WHO 的標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行分析[11-12]。氨基酸評(píng)分（AAS）、化學(xué)評(píng)分（CS）、必需氨基酸指數(shù)（EAAI）、生物價(jià)（BV）、營(yíng)養(yǎng)指數(shù)（NI）按照BANO 等[13]和FAO[14]的方法進(jìn)行計(jì)算與評(píng)價(jià)。根據(jù)氨基酸平衡理論，利用標(biāo)準(zhǔn)模式譜計(jì)算必需氨基酸的氨基酸比值（RAA）氨基酸比值系數(shù)（RC）[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將1.4.2 制備得到的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列溶液置于進(jìn)樣瓶進(jìn)行測(cè)定。波長(zhǎng)為570 nm 處測(cè)天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸含量；波長(zhǎng)440 nm 處測(cè)脯氨酸含量；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸分析。各氨基酸實(shí)際濃度（x，μmol·L-1）與峰面積（y）的線性回歸方程見(jiàn)表1。

表1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程Tab.1 Linear regression equation for amino acid standard curve

由表1 可知，半胱氨酸線性關(guān)系在0.5～50.0 μmol·L-1內(nèi)良好，其他16 種氨基酸線性關(guān)系在1～100 μmol·L-1內(nèi)良好。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取6 份大白樁菇子實(shí)體粉0.005 g，按照1.4.1的方法制備樣品測(cè)定液，測(cè)定17 種氨基酸的含量，分析6 次重復(fù)（Y1～Y6）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD（relative standard deviation，RSD）。6 次重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of reproducibility test

如表2世紀(jì)，17 種氨基酸含量的RSD 均小于10%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3 精密度試驗(yàn)

稱(chēng)取1 份（0.005 g）大白樁菇子實(shí)體粉末，按照1.4.1 的方法進(jìn)行處理制備樣品測(cè)定液，氨基酸分析儀上連續(xù)進(jìn)樣6 針進(jìn)行測(cè)定。連續(xù)進(jìn)樣6 針檢測(cè)的精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of precision test

17 種氨基酸含量的如表3世紀(jì)，RSD 均小于10%，表明精密度良好。

2.4 回收率試驗(yàn)

使用低、中、高3 個(gè)濃度（即標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度分別為10、25、50 μg·L-1）加入法測(cè)定回收率，每個(gè)濃度下測(cè)定3 個(gè)平行樣品?；厥章试囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4 可知，3 個(gè)不同質(zhì)量濃度下回收率為80%～120%，RSD 均小于10%，表明回收良好。

2.5 水解氨基酸及蛋白質(zhì)分析與評(píng)價(jià)

測(cè)定大白樁菇水解氨基酸的組成含量，結(jié)果如表5世紀(jì)。

表5 大白樁菇子實(shí)體中水解氨基酸的組成及含量Tab.5 Composition and content of hydrolyzed amino acids in the fruit body of Leucopaxillus giganteus

由表5 可知，大白樁菇共測(cè)得17 種水解氨基酸（色氨酸未測(cè)），氨基酸總含量為132.11 mg·g-1；其中必需氨基酸為43.7 mg·g-1，占氨基酸總量33.08%；非必需氨基酸88.41 mg·g-1，占比66.92%。組成藥用的氨基酸有10 種，分別是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸，其含量占水解氨基酸總量的88.89%。藥用氨基酸維持著人體機(jī)能的碳平衡，且某些氨基酸只能通過(guò)食物的攝取才能得到補(bǔ)充，說(shuō)明大白樁菇具有良好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。藥用氨基酸中谷氨酸的含量最高，占氨基酸總含量的18.09%。谷氨酸是一種神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)改善人體腸道功能、腦功能、神經(jīng)功能和治療精神性疾病具有重要的作用[16-17]。其次是天冬氨酸（11.63%），說(shuō)明大白樁菇可能在保護(hù)心肌、消除疲勞等方面具有調(diào)節(jié)意義[18]。天門(mén)冬酰胺和谷氨酰胺在水解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生天冬氨酸和谷氨酸[19]。大白樁菇也富含亮氨酸（6.97%），亮氨酸具有調(diào)節(jié)糖脂代謝功能，改善脂肪沉積的作用[20]。蛋氨酸和半胱氨酸含量較低，分別占水解氨基酸總量的0.83%和1.13%，可能是由于這2 種氨基酸與空氣接觸，發(fā)生氧化反應(yīng)造成了部分氨基酸的損失[21]。

對(duì)大白樁菇水解氨基酸中人體必需氨基酸組成進(jìn)行分析，并與FAO/WHO 標(biāo)準(zhǔn)模式及雞蛋模式進(jìn)行比較，計(jì)算分析各評(píng)分?jǐn)?shù)值。其中，RAA 為樣品中某氨基酸含量與FAO/WHO 標(biāo)準(zhǔn)模式氨基酸含量的比值，RC 為RAA 與RAA 平均數(shù)的比值，AAS 為樣品中某氨基酸含量與FAO/WHO 模式譜氨基酸含量的比值乘以100，CS 為樣品中某氨基酸含量與雞蛋模式譜氨基酸含量的比值乘以100。結(jié)果詳見(jiàn)表6。

表6 大白樁菇子實(shí)體中必需氨基酸的組成分析Tab.6 Composition analysis of essential amino acids in the fruit body of Leucopaxillus giganteus

由表6 可知，大白樁菇中蛋氨酸＋半胱氨酸占總水解氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于標(biāo)準(zhǔn)模式譜。從必需氨基酸的氨基酸比值、氨基酸比值系數(shù)計(jì)算結(jié)果可以看出，大白樁菇中蛋氨酸＋半胱氨酸含量較低，RC 值為0.55，說(shuō)明其為大白樁菇的第一限制氨基酸。在FAO/WHO 模式中，除纈氨酸外，大白樁菇其他必需氨基酸含量均高于氨基酸模式譜的要求。大白樁菇中蛋氨酸＋半胱氨酸的CS 值為35.65，說(shuō)明其為大白樁菇的第一限制氨基酸，與RC 值分析結(jié)果一致。

對(duì)大白樁菇水解氨基酸的EAAI、CBV 和NI 進(jìn)行分析。其中EAAI 為樣品中所有必需氨基酸CS 值的幾何平均數(shù)；CBV 為樣品必需氨基酸指數(shù)與1.09的乘積再減去11.7；NI 為樣品中必需氨基酸指數(shù)與蛋白質(zhì)含量的乘積除以100。經(jīng)計(jì)算，大白樁菇的EAAI 值為69.96。必需氨基酸指數(shù)（EAAI）的概念由OSER[22]提出，當(dāng)EAAI＞90，說(shuō)明樣品的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高；當(dāng)80≤EAAI＜90 時(shí)，說(shuō)明樣品的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值為良；當(dāng)EAAI＜70，說(shuō)明樣品的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低。因此，大白樁菇的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值接近良。生物價(jià)越高表示可利用程度越高，CBV 與EAAI 之間的關(guān)系呈線性，趨勢(shì)與EAAI 一致。營(yíng)養(yǎng)指數(shù)（NI）方法中包括粗蛋白含量與必需氨基酸組成，以此進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，故評(píng)價(jià)更為全面和準(zhǔn)確。大白樁菇營(yíng)養(yǎng)指數(shù)為34.36，因大白樁菇粗蛋白含量較高，所以營(yíng)養(yǎng)指數(shù)較高，且超過(guò)了雞腿菇（Coprinus comatus）、香菇（Lentinus edodes）、茶樹(shù)菇（Agrocybe aegirit）和黑木耳（Auricularia auricula）等常見(jiàn)食用菌[23]。

3 結(jié)論與討論

在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》（GB 5009.124-2016）的基礎(chǔ)上，增加了半胱氨酸含量的測(cè)定方法，對(duì)樣品處理方法進(jìn)行了改進(jìn)，將改進(jìn)方法用于大白樁菇子實(shí)體中17 種水解氨基酸的測(cè)定，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證分析。結(jié)果表明，本方法具有線性關(guān)系良好、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、回收率高的特點(diǎn)，可用作大白樁菇中17 種水解氨基酸的測(cè)定方法。大白樁菇水解氨基酸測(cè)定方法的建立對(duì)進(jìn)一步研究大白樁菇蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。

研究表明大白樁菇是一種高蛋白野生食用菌，粗蛋白含量高達(dá)49.12 g·100-1·g-1。本試驗(yàn)中測(cè)定大白樁菇17 種水解氨基酸總含量為132.11 mg·g-1。其中，必需氨基酸43.7 mg·g-1，占氨基酸總量的33.08%；藥用氨基酸總量為88.89 mg·g-1，占氨基酸總量的67.28%。與FAO/WHO 模式和雞蛋模式相比，大白樁菇第一限制氨基酸為蛋氨酸+半胱氨酸。除纈氨酸外，大白樁菇其他必需氨基酸含量均高于氨基酸模式譜的要求。大白樁菇的必需氨基酸指數(shù)為69.96，表明其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值接近良好，而與其蛋白質(zhì)含量相結(jié)合計(jì)算后，其營(yíng)養(yǎng)指數(shù)達(dá)到34.36，表明大白樁菇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，且超過(guò)香菇、黑木耳等常見(jiàn)食用菌。綜上所述，大白樁菇是一種氨基酸分布均衡，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的高蛋白食用菌。