劉 愚，霍文嚴，賀雪蓮，陳 軍，張黎光，祁 鵬，戴 璐，李峻志**

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710000；2.陜西省太白林業(yè)局，陜西 寶雞 721600）

擬鬼傘屬（Coprinopsis）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）傘菌目（Agaricales）小脆柄菇科（Psathyrellaceae）[1]。由于其孢子呈暗色，部分種具有菌蓋會自溶成黑色的特點，1797年P(guān)ERSON[2]將此類大型真菌物種從蘑菇屬（Agaricus）中分離出來，歸為鬼傘屬。1994年HOPPLE[3]使用分子生物學(xué)手段發(fā)現(xiàn)鬼傘屬是非單系的。2001年REDHEAD[4]結(jié)合分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，證明了HOPPLE 的結(jié)論，并將原鬼傘屬的物種重新分為4 個新屬：鬼傘屬（Coprinus）、擬鬼傘屬（Coprinopsis）、小鬼傘屬（Coprinellus）和近地傘屬（Parasola）；其中后3 個屬分入小脆柄菇科（Psathyrellaceae）。2020年W?CHTER 和MELZER[5]對小脆柄菇科進行系統(tǒng)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)小鬼傘屬非單系，又重新分類，建立了刺毛鬼傘屬（Tulosesus）和心孢鬼傘屬（Narcissea）；將原Coprinellus pakistanicus歸入新屬Punjabia，這是目前對鬼傘類大型真菌最新的科學(xué)分類。

黃柏塬自然保護區(qū)地處秦嶺南麓，是秦嶺自然保護區(qū)群的核心區(qū)域，與老縣城保護區(qū)、佛坪自然保護區(qū)、長青保護區(qū)、牛尾河自然保護區(qū)、太白山自然保護區(qū)相鄰。該保護區(qū)是北亞熱帶和暖溫帶的過渡地帶，地處中國南北植物交匯處，因此，秦嶺植被垂直帶譜明顯，植物區(qū)塊化明顯，容易形成局部的生態(tài)和環(huán)境圈，生態(tài)環(huán)境獨特[6]。特殊的地理位置與多樣的山地垂直帶譜，為秦嶺大型真菌的生物多樣性提供了良好基礎(chǔ)[7]。

2021年至2022年，對陜西省內(nèi)黃柏塬自然保護區(qū)的大型真菌生物多樣性進行了系統(tǒng)的調(diào)查，共采集到大型真菌標本150 余份。通過結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)的方法，將編號為20210526 號標本鑒定為吉林擬鬼傘（Coprinopsis jilinensis）。這是首次在陜西省境內(nèi)發(fā)現(xiàn)吉林擬鬼傘，不僅豐富了秦嶺地區(qū)大型真菌資源的物種多樣性，也對秦嶺地區(qū)的生態(tài)環(huán)境保護提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

子實體樣品（編號20210526），于2021年9月9日采集自太白縣黃柏塬自然保護區(qū)。干燥標本現(xiàn)保藏于陜西省微生物研究所秦嶺菌物標本館（SXIM）。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

在野外采集樣本時，對樣本的生境、外觀形態(tài)進行拍照留存，并進行相應(yīng)的觀察記錄。內(nèi)容包括生境特征；菌蓋大小、形狀、顏色、表面特征；菌褶形狀、顏色、寬度；菌肉顏色；菌柄形狀、長度、直徑、表面特征等；傷變色，是否有乳汁產(chǎn)生等[8]。之后使用干燥變色硅膠處理樣品，防止標本發(fā)生美拉德反應(yīng)。顯微觀察時，先使用5% KOH 溶液對干燥的樣品進行復(fù)水處理，制作切片，用剛果紅染色。使用Olympus BX43 光學(xué)顯微鏡對樣品的菌蓋、菌絲、菌幕菌絲、孢子、擔(dān)子等顯微結(jié)構(gòu)進行觀察，并測量記錄菌絲、孢子等的大小[9]。

1.2.2 分子生物學(xué)檢測

1）DNA 提取。使用生工生物工程股份有限公司的真菌基因組DNA 提取試劑盒，按照說明書提取樣本基因組DNA。

2）ITS 序列PCR 擴增。以樣本基因組DNA 為模板，以ITS4/ITS5 作為擴增引物，對樣本的ITS 序列進行PCR 擴增。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸6 min。取15 μL PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳（參數(shù)為120 V，60 min）檢測。

3）將樣本的PCR 擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

1）ITS 序列分析。使用DNAMAN 9.0 對測序結(jié)果進行人工排除序列誤讀檢查。將檢查合格的序列上傳至NCBI 中進行BLAST 比對，確認樣本的拉丁名。下載與樣本相似度高的18 種擬鬼傘屬其他物種的堿基序列，用DNAMAN 進行序列比對，對下載的同物種序列進行整理并保存為fasta 文件。

2）系統(tǒng)發(fā)育分析。以毛頭鬼傘Coprinus comatus（KX015766）作為外類群，用MEGA 7 軟件，采用鄰接法（neighbor-joining method）以Kimura-2 parameter 模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 生境特征

樣本于2021年9月采自針闊混交林（以油松和櫟類樹種為主）。采集地海拔為1 800～2 000 m，散生或群生于林地腐殖土上，與饒固等[10]的描述相似。

2.1.2 宏觀結(jié)構(gòu)特征

吉林擬鬼傘子實體的形態(tài)特征見圖1。

圖1 吉林擬鬼傘子實體Fig.1 Fruit body of Coprinopsis jilinensis

如圖1世紀，子實體菌蓋直徑3～7 cm，幼時半球型，成熟后扁半球型，中間稍臍凸，表面淺褐色，被白色短絨毛，有絲狀菌膜幕，幼時多，成熟后菌蓋邊緣有少量殘留；菌肉厚，白色；菌褶彎生，寬2 cm，米白色，不等長，波狀，邊緣鋸齒狀，緊密；菌柄長3～6 cm，直徑1.0～1.5 cm，中生，棒狀，由上向下逐漸變粗，基部稍膨大，顏色同菌蓋，表面被細絨毛鱗片，肉質(zhì)，中心海綿質(zhì)，上端有細縱條紋，基部有白色菌絲體與附著物相連接。

2.1.3 微觀結(jié)構(gòu)特征

吉林擬鬼傘的顯微結(jié)構(gòu)特征詳見圖2。

圖2 吉林擬鬼傘的顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 Microscopic features of Coprinopsis jilinensis

如圖2世紀，樣本擔(dān)孢子4.3 μm×8.7 μm，杏仁型，孢子壁薄，光滑，淡黃色至黃褐色；擔(dān)子（3.8～11.5）μm×（29.8～34.5）μm，棒狀，無色近透明，壁薄，有2～4 個擔(dān)子小梗，為無隔擔(dān)子；菌蓋菌絲直徑9.1～18.2 μm，無分枝，有橫隔，壁薄；囊狀體（3.6～8.9）μm×（21.4～33.9）μm，棒狀；菌幕菌絲直徑13.6～20.5 μm，無分枝，有橫隔。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

經(jīng)測序，編號為20210526 的樣品ITS 序列全長為751 bp，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖3。

圖3 基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

如圖3世紀，本次在黃柏塬地區(qū)采集到的樣本20210526 與之前學(xué)者研究的吉林擬鬼傘為同一分支（其序列一致性為100%），支持率100%，并且與擬鬼傘屬的其他物種分開。分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明樣本20210526 為吉林擬鬼傘Coprinopsis jilinensis。

3 結(jié)論

吉林擬鬼傘子的實體小型至中型，不自溶，與鬼傘屬和小脆柄菇科的大部分物種不同。只通過宏觀形態(tài)鑒定，不易分辨。吉林擬鬼傘的命名者饒固等[10]發(fā)布并描述了吉林擬鬼傘的生物學(xué)特征，該物種最先被發(fā)現(xiàn)是在吉林省敦化市，生長在針闊混交林。分子生物學(xué)的發(fā)展對大型真菌的分類有著關(guān)鍵性的作用，通過分子生物學(xué)分析，可以將很多宏觀形態(tài)學(xué)相近的不同物種區(qū)分出來，使得分類系統(tǒng)更加完善[3，5]。本試驗中通過結(jié)合分子手段和宏觀特征，確認采集自陜西秦嶺地區(qū)的樣本為吉林擬鬼傘，為陜西省新分布記錄種。