張運(yùn)祺，鄭自強(qiáng)，邢浩博，應(yīng)超，蘭茂華，任志強(qiáng)，2，衛(wèi)春會(huì)，2*

（1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000；2.中國(guó)輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

白酒釀造離不開(kāi)曲，曲的品質(zhì)影響白酒的酒質(zhì)和酒體風(fēng)格，按制曲溫度可分為低溫曲、中溫曲、中高溫曲和高溫曲[1]。因高溫制曲工藝更能增加曲香，白酒企業(yè)青睞于使用中高、高溫曲釀造名優(yōu)酒，在高溫釀造環(huán)境中，細(xì)菌尤其是嗜熱芽孢桿菌經(jīng)環(huán)境篩選成為優(yōu)勢(shì)菌群[2-3]。嗜熱芽孢桿菌能夠代謝香味物質(zhì)，分泌纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶等多種功能酶，是中高溫和高溫曲內(nèi)的重要微生物，其作用主要突出表現(xiàn)在將淀粉和蛋白質(zhì)降解為氨基酸和可發(fā)酵性糖，嗜熱芽孢桿菌的發(fā)酵特性與制曲的“三高”工藝匹配，優(yōu)良嗜熱芽孢桿菌的篩選與應(yīng)用成為行業(yè)內(nèi)提高酒曲品質(zhì)的重要研究方向[4-5]。

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展，提高優(yōu)質(zhì)酒率需求逐漸增加，釀造優(yōu)質(zhì)酒所用的高溫曲品質(zhì)備受關(guān)注，大曲功能芽孢桿菌微生物相關(guān)報(bào)道屢見(jiàn)不鮮。張立強(qiáng)[6]從大曲中分離篩選得到2 株纖溶酶活力較高的貝萊斯芽孢桿菌（Bacilus velezensis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），其能夠合成活性肽、地衣素和吡嗪類化合物等多種生理活性物質(zhì)；劉曉昆[7]研究了高溫大曲中10 株產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶的細(xì)菌菌株,確定其中8 株為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)，2 株為枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp.subtilis)，為揭示大曲功能微生物及其作用、增強(qiáng)白酒風(fēng)味、提高白酒產(chǎn)量提供了數(shù)據(jù)參考；馮利芳[8]從清香大曲中篩選出1 株高產(chǎn)中性蛋白酶的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，經(jīng)制曲應(yīng)用，強(qiáng)化大曲的糖化力提高了13.7 %，液化力提高了125 %，中性蛋白酶活提高了101.5 %，酸性蛋白酶活提高了7.65 倍。雖然大曲中芽孢桿菌微生物的資源利用受到學(xué)者關(guān)注，但在高溫極端制曲環(huán)境中可發(fā)揮良好產(chǎn)酶功能的嗜熱菌研究尚有不足。

本研究以高溫大曲為菌源，篩選具有產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶功能的嗜熱芽孢桿菌，經(jīng)生理生化鑒定和分子鑒定確定其種屬關(guān)系，對(duì)其生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酶特性進(jìn)行研究，并用于強(qiáng)化大曲探究其功能特征，以期為高溫曲的優(yōu)化應(yīng)用提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

高溫大曲取自川北某濃香型酒廠（頂溫約為62 ℃），取樣后粉碎均勻混合分裝于密封袋，4 ℃保存；麩皮、高粱為市售。

1.1.2 試劑

3，5-二硝基水楊酸（化學(xué)純）、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；三氯乙酸、溴百里香酚藍(lán)、羧甲基纖維素鈉（分析純），成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 儀器設(shè)備

SW-CJ-IF 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司；TC1000-G PCR 擴(kuò)增儀，上海歡奧科技有限公司；MicroSreen HT 實(shí)時(shí)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀，杰靈儀器制造天津有限公司；A360 紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司；ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，日本SONY 公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L。（固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L。）

淀粉固體培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g/L，牛肉膏0.9 g/L，蛋白胨3 g/L，氯化鈉1.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH7.0。

酪素固體培養(yǎng)基：干酪素10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，溴百里香酚藍(lán)0.05 g/L，瓊脂15 g/L，pH7.0。

羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基：羧甲基纖維素10 g/L，蛋白胨2 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，氯化鈉0.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 嗜熱芽孢桿菌的富集

無(wú)菌條件取大曲樣品5.0 g 于145 mL 無(wú)菌生理鹽水中，置于120 r/min 搖床30 min，隨后置于80 ℃水浴鍋中水浴處理1 h，取菌懸液5 mL 接入滅菌冷卻后的LB 液體培養(yǎng)基，接種量為5 %（v/v），培養(yǎng)溫度為60 ℃，于120 r/min 搖床內(nèi)培養(yǎng)24 h，為富集液[8]。

1.2.2 嗜熱芽孢桿菌的篩選

（1）初篩。取富集液在超凈工作臺(tái)內(nèi)用LB 固體培養(yǎng)基適宜梯度下稀釋涂布，60 ℃倒置培養(yǎng)24 h，分別挑取形態(tài)不同的單菌落于LB 固體培養(yǎng)基相同條件下劃線倒置培養(yǎng)24 h。

（2）復(fù)篩。挑取劃線后生長(zhǎng)出的單菌落接入滅菌后的LB 液體培養(yǎng)基中，60 ℃培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接一次，為種子液，取種子液裝入25%甘油管，-80 ℃儲(chǔ)藏備用；挑取單菌落點(diǎn)植于淀粉培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基和羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，50 ℃培養(yǎng)48 h 后觀察透明圈的大小，測(cè)量并計(jì)算透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)的比值(D/d)，篩選產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株。

淀粉酶培養(yǎng)基透明圈的觀察采用碘液染色法[9]；蛋白酶培養(yǎng)基透明圈直接觀察；纖維素酶培養(yǎng)基透明圈的觀察采用剛果紅染色法[10]。

1.2.3 嗜熱芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)鑒定

取種子液于LB 固體培養(yǎng)基適宜梯度下稀釋涂布培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度為60 ℃，觀察菌落形態(tài)特征情況，并拍照記錄。

1.2.4 嗜熱芽孢桿菌的分子生物學(xué)鑒定

取種子液提取細(xì)菌DNA，使用Takara 試劑盒提取細(xì)菌DNA，操作步驟為試劑盒步驟。

PCR 引物[11]：正向引物為27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')，反向引物為1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。

PCR 體系：27F 引物1 μL、1492R 引物1 μL、MIX 酶12.5μL、DNA 模板1μL、ddH2O 9.5μL。

PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，72 ℃補(bǔ)充延伸10 min，循環(huán)30 次。

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，于凝膠色譜成像儀下觀察擴(kuò)增結(jié)果。將擴(kuò)增結(jié)果好的引物送至上海生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 中的Gen Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，利用MEGA7.0 軟件建樹(shù)確定菌種。

1.2.5 測(cè)定方法

1.2.5.1 嗜熱芽孢桿菌的生長(zhǎng)特性分析

（1）生長(zhǎng)曲線測(cè)定。配制LB 液體培養(yǎng)基，滅菌后按接種量為1%（v/v）接入種子液，180 r/min 搖床內(nèi)40 ℃溫度下培養(yǎng)24 h，空白組為未接種的培養(yǎng)基。每隔1 h 取適量菌液，測(cè)定發(fā)酵液的OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。

（2）生長(zhǎng)特性測(cè)定。配制LB 液體培養(yǎng)基，分別設(shè)置在不同初始pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、不同NaCl 濃度(0 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %，濃度單位為m/v)、不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（0 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %）以及不同溫度（35 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）下培養(yǎng)種子液，測(cè)定發(fā)酵液的OD600nm值，探究嗜熱芽孢桿菌不同條件下的生長(zhǎng)情況。

1.2.5.2 嗜熱芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性分析

將菌株單菌落以2 %(v/v)的接種量接入LB培養(yǎng)基，55 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)。取發(fā)酵液5000 r/min 離心10 min，上清液作為粗酶液[12]。蛋白酶酶活力的測(cè)定方法采用福林酚法[13]；淀粉酶酶活力的測(cè)定方法采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[14]。

蛋白酶活力單位：在55 ℃、pH7.0 的條件下，水解酪素1 min 產(chǎn)生1 μ g 酪氨酸作為一個(gè)酶活力單位，用U 來(lái)表示。

淀粉酶活力單位：在55 ℃、pH7.0 的條件下，以每分鐘水解底物可溶性淀粉生成1 μ mol 還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需酶的量作為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.5.3 嗜熱芽孢桿菌強(qiáng)化麩曲應(yīng)用

參考傳統(tǒng)麩曲制作工藝，制作淺盤麩曲，以磚狀金屬盒為模具，取100 g 麩皮和10 g 麥粉混勻，4 層紗布封口，121 ℃滅菌20 min，烘干備用；取10 mL種子液高速離心集菌，用無(wú)菌水將菌體接種至麩皮麥粉中作為實(shí)驗(yàn)組，以直接添加等量無(wú)菌水的為空白組，拌勻封口，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 天后烘干備用[15-17]。

1.2.5.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果均采用x±Sd 的形式表示，SPSS 19.0 數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，Excel 和origin 軟件進(jìn)行圖表制作；采用DNAstar 進(jìn)行DNA 序列修剪，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)網(wǎng)站進(jìn)行同源性比較，使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱芽孢桿菌初篩和復(fù)篩結(jié)果分析

選擇初篩后的菌種經(jīng)劃線純化，得到單菌落，結(jié)合革蘭氏染色鏡檢觀察菌落形態(tài)特征，并將分離出的純種菌株點(diǎn)植到淀粉培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基和羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，得到1 株具有良好產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力的嗜熱芽孢桿菌，命名為ZJY-1，其菌落特征、鏡檢及透明圈復(fù)篩結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知，菌株ZJY-1 的菌落緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，呈扁平狀，白色，菌落不透明，暗沉，表面干燥，菌落邊緣不整齊；通過(guò)鏡檢觀察，菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈紫色；3種培養(yǎng)基復(fù)篩后，菌株ZJY-1 淀粉酶透明圈直徑為1.50 cm，菌落直徑為0.30 cm，直徑比為5.00，蛋白酶透明圈直徑為1.70 cm，菌落直徑為0.60 cm，直徑比為2.83，纖維素酶篩選培養(yǎng)基上無(wú)透明圈產(chǎn)生。

圖1 ZJY-1 菌落特征、鏡檢及透明圈復(fù)篩結(jié)果

綜合上述結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[18]，初步確定菌株ZJY-1 為具備一定產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力的嗜熱革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌。

2.2 嗜熱芽孢桿菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果分析

為進(jìn)一步確定菌株ZJY-1 的種屬關(guān)系，提取菌株ZJY-1 的DNA，通過(guò)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳觀察條帶，將合格的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，基于16S rDNA 基因序列菌株ZJY-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。由圖2 可知，菌株ZJY-1 與土芽孢桿菌屬Geobacillus高度相關(guān)，且與嗜熱脂肪芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus strain）S2M(KJ722527)聚為同一支，其同源性為100.00 %，建樹(shù)結(jié)果表明菌株ZJY-1 為嗜熱脂肪芽孢桿菌。

綜合菌落特征、鏡檢及分子生物學(xué)結(jié)果，確定菌株ZJY-1 為土芽孢桿菌屬的嗜熱脂肪芽孢桿菌。

2.3 菌株ZJY-1 的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

掌握細(xì)菌生長(zhǎng)規(guī)律有助于研究其生理和生產(chǎn)實(shí)踐。本試驗(yàn)對(duì)菌株ZJY-1 的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果如圖3 所示，可看出菌株ZJY-1 在0～5 h 時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，處于停滯期，在6～16 h 時(shí)，菌株生長(zhǎng)迅速，為對(duì)數(shù)期，在16～20 h 時(shí)生長(zhǎng)更為緩慢，為平穩(wěn)期，21 h 后菌株ZJY-1 進(jìn)入衰亡期。

2.4 嗜熱芽孢桿菌的生長(zhǎng)特性分析

圖2 基于16S rDNA 基因序列菌株ZJY-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 菌株ZJY-1 的生長(zhǎng)曲線測(cè)定分析

菌株應(yīng)用方向主要為白酒制曲環(huán)境，環(huán)境差異會(huì)直接影響微生物的新陳代謝活動(dòng)[19]。為將菌株ZJY-1 用于生產(chǎn)應(yīng)用，本文在不同的pH 值、溫度、NaCl 濃度及乙醇濃度下進(jìn)一步考察了菌株ZJY-1的生長(zhǎng)特性，結(jié)果如圖4 所示。

pH 影響了細(xì)菌分泌酶的表達(dá)，適宜的pH 值條件可保證芽孢桿菌生命活動(dòng)正常進(jìn)行（圖4a），菌株ZJY-1 隨著培養(yǎng)初始pH 值的增加生長(zhǎng)更加旺盛，并在初始pH7.0 時(shí)生長(zhǎng)最好，當(dāng)初始pH 值繼續(xù)增加至偏堿性時(shí)，生長(zhǎng)狀況下降。秦立芹[20]從醬香型白酒釀造環(huán)境中篩選得到1 株產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)其在pH5～9 范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好。結(jié)果表明，中性環(huán)境更適宜菌株ZJY-1 的生長(zhǎng)。

圖4 菌株ZJY-1 的生長(zhǎng)特性測(cè)定分析

圖5 菌株ZJY-1 的產(chǎn)酶特性測(cè)定分析

芽孢桿菌可生成芽孢，嗜熱菌對(duì)高溫環(huán)境有著更強(qiáng)的適應(yīng)能力，但過(guò)高的溫度會(huì)影響功能酶的表達(dá)，降低細(xì)胞代謝能力（圖4b），隨著培養(yǎng)溫度的增加，菌株ZJY-1 菌體濃度增加，對(duì)高溫表現(xiàn)出良好的應(yīng)激性，在培養(yǎng)溫度為55 ℃時(shí)生長(zhǎng)最為旺盛，OD600值此時(shí)最高，達(dá)到了0.85，隨著培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高，細(xì)菌生命活動(dòng)受到抑制，但在65 ℃時(shí)依舊可存活，當(dāng)培養(yǎng)溫度到達(dá)70 ℃時(shí)，菌株ZJY-1 基本停止生命活動(dòng)，結(jié)果表明，菌株ZJY-1 有良好的嗜熱性，在50～65 ℃范圍內(nèi)皆可生長(zhǎng)旺盛。

鹽濃度與乙醇濃度常作為微生物生長(zhǎng)特性的考察因素，其改變了培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓和細(xì)胞膜的吸收，高鹽濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌失水死亡，高乙醇濃度會(huì)給細(xì)菌帶來(lái)毒害作用從而失活[21]。由圖4 可知（圖4c、圖4d），菌株ZJY-1 的最高耐受NaCl 濃度為4%，超過(guò)4%時(shí)菌株趨近死亡，最高乙醇耐受濃度為4 %，在6 %濃度及更高濃度下細(xì)菌停止代謝。結(jié)果表明，菌株ZJY-1 對(duì)于環(huán)境鹽濃度和乙醇濃度耐受表征接近大多數(shù)細(xì)菌，但并未表征出優(yōu)良的NaCl 鹽和乙醇耐受性。

2.5 嗜熱芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性分析

通過(guò)前期試驗(yàn)，菌株ZJY-1 可能同時(shí)具備產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力，大曲中的細(xì)菌微生物主要表達(dá)淀粉酶和蛋白酶，為進(jìn)一步了解其產(chǎn)酶特性，在適宜條件下，每隔12 h 測(cè)定淀粉酶活和蛋白酶活，在不同發(fā)酵時(shí)間段酶活力測(cè)定結(jié)果如圖5 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株ZJY-1 蛋白酶和淀粉酶的活力呈先增加后下降趨勢(shì)，菌株的蛋白酶酶活在36 h時(shí)達(dá)到最高，達(dá)到了181.8 U/g±8.3 U/g，淀粉酶酶活在24 h 達(dá)到最高，最高達(dá)137.6 U/g±5.1 U/g，隨后隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)酶活顯著降低，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間到48 h時(shí)達(dá)到較低值，淀粉酶活僅有32.5 U/g±3.1 U/g，蛋白酶約為27.3 U/g±7.1 U/g。

2.6 嗜熱芽孢桿菌強(qiáng)化麩曲應(yīng)用

為初步探究菌株ZJY-1 應(yīng)用于曲的產(chǎn)酶能力，以菌株ZJY-1 為菌源制備種子液，接入麩皮培養(yǎng)基制備嗜熱芽孢桿菌麩曲，測(cè)定其麩曲生物量和功能酶活力，考察ZJY-1 強(qiáng)化麩曲酶活力和生物量指標(biāo)，結(jié)果如表1 所示，以菌株ZJY-1 為菌源制備的強(qiáng)化麩曲仍可保持較高的酶活力，淀粉酶活為133.5 U/g±12.5 U/g，蛋白酶活達(dá)到了175.4 U/g±4.8 U/g；對(duì)其生物量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZJY-1 強(qiáng)化麩曲的生物量指標(biāo)較高，達(dá)到了5.7×1010±2.8×109CFU/g，高于市售麩曲生物量指標(biāo)，菌株ZJY-1表現(xiàn)出了優(yōu)異的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力，發(fā)揮其酶活性功能的前提下，生物量指標(biāo)突出，可用于強(qiáng)化麩曲擴(kuò)培。

3 結(jié)論

本課題以優(yōu)化高溫大曲發(fā)展為背景，從高溫大曲中篩選芽孢桿菌，并初步探究了菌株應(yīng)用于強(qiáng)化曲的價(jià)值，結(jié)果如下：

表1 ZJY-1 強(qiáng)化麩曲酶活及生物量測(cè)定分析

從高溫大曲中篩選出了1 株嗜熱菌株ZJY-1，鑒定為嗜熱脂肪芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus strain），菌株具備產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力，分析其生長(zhǎng)特性發(fā)現(xiàn)菌株鹽耐受和乙醇耐受能力為芽孢桿菌普遍耐受范圍，適宜生長(zhǎng)在中性pH值環(huán)境，在65 ℃高溫環(huán)境下仍長(zhǎng)勢(shì)良好；在不同發(fā)酵時(shí)間下進(jìn)行酶活力檢測(cè)，其淀粉酶活力最高為133.5 U/g±12.5 U/g，蛋白酶活力最高為175.4 U/g±4.8 U/g；以菌株ZJY-1 為菌源制備強(qiáng)化麩曲，ZJY-1麩曲具有良好產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力，且生物量指標(biāo)較高，可達(dá)到5.7×1010±2.8×109CFU/g。

本研究突破了高溫大曲菌種應(yīng)用中的不耐高溫、功能酶活性不足、菌種生物量低等難點(diǎn)，豐富了高溫大曲功能菌資源，為高溫曲優(yōu)化提供了一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)指導(dǎo)。