彭奎，張磊，陳波，劉新宇，杜鵬程，劉念，劉義，王超凱，李覓，常少健，張蓓蓓，楊天涯，甘元甲，馮霞*

（1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司，四川成都 611130；2.四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺 646523；3.新疆伊力特實(shí)業(yè)股份有限公司，新疆伊犁 835800；4.四川遠(yuǎn)鴻小角樓酒業(yè)有限公司，四川巴中 636400；5.崇州市天宮酒廠，四川崇州 611230；6.四川佳樂酒業(yè)股份有限公司，四川瀘州 646000）

中國白酒中的四甲基吡嗪由美拉德反應(yīng)生成，在制曲和堆積發(fā)酵中產(chǎn)生，經(jīng)蒸餾帶入酒中，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板積聚的作用，賦予中國白酒以健康功能。高溫制曲、高溫堆積是醬香型白酒獨(dú)特的生產(chǎn)工藝，制曲階段和堆積過程產(chǎn)生的四甲基吡嗪是白酒中四甲基吡嗪的主要來源之一。四甲基吡嗪能產(chǎn)生類似醬香、醬油和麥醬香的風(fēng)味，其他的吡嗪類物質(zhì)都沒有，只能認(rèn)為吡嗪類物質(zhì)與醬酒有關(guān)，卻還沒有足夠有力的證據(jù)證明吡嗪及加熱香氣是醬香型酒的主體香氣物質(zhì)[1-4]。

醬香型白酒的生產(chǎn)周期為一年，在端午節(jié)期間開始制曲，重陽節(jié)期間下沙（投糧），經(jīng)歷九次蒸煮，八次發(fā)酵，七次取酒，再經(jīng)過分型定級，才能封壇入存，整個(gè)過程需要經(jīng)歷一年的時(shí)間。針對醬香型白酒在生產(chǎn)上的投資大、工藝復(fù)雜、生產(chǎn)周期長等特點(diǎn)，開發(fā)出一種微生物強(qiáng)化菌劑，用于醬香型調(diào)味酒的生產(chǎn)，對于縮短生產(chǎn)周期和創(chuàng)新生產(chǎn)工藝，研發(fā)出獨(dú)有的醬香風(fēng)格白酒有著重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：醬香型白酒堆積糟醅樣品5 個(gè)，高溫大曲樣品3 個(gè)。

編號(hào)：LJ-4-0：第四次堆積表面糟醅，2019 年樣品；LJ-4-30：第四次堆積距表面30 cm 糟醅，2019 年樣品；LJ2-4-0：第四次堆積表面糟醅，2020年樣品；LJ2-4-30：第四次堆積距表面30 cm 糟醅，2020 年樣品；LJ2-4DX：第四次堆積堆心糟醅，2020年樣品；DQB：白色大曲；DQH：黑色大曲；DQHuang：黃色大曲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物分離

將采自醬香型白酒第四次堆積酒糟的兩個(gè)樣品LJ-4-0、LJ-4-30 加水混勻，經(jīng)80 ℃加熱20 min后稀釋涂瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落平板劃線，24 h 后再挑取單菌落于斜面培養(yǎng)24 h 后保存。LJ-4-0 樣品挑菌9 個(gè)，LJ-4-30 樣品挑菌10 個(gè)，共分離出19 株菌種，經(jīng)過分子鑒定確定為芽孢桿菌。所得菌種通過菌落及細(xì)胞圖像采集、分子鑒定后制成凍干管保藏于四川省微生物資源共享平臺(tái)菌種保藏中心。

1.2.2 產(chǎn)醬香風(fēng)味物質(zhì)的菌種篩選

麩皮培養(yǎng)基：麩皮過40 目篩，稱取10 g 裝入500 mL 三角瓶中，加水190 mL，紗布封口，121 ℃滅菌20 min。接入培養(yǎng)8 h 的菌液5 mL，36 ℃±1 ℃，160 r/min 培養(yǎng)9 d，測定四甲基吡嗪、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、糠醛4種風(fēng)味物質(zhì)含量。

樣品預(yù)處理：發(fā)酵液5000 r/min 離心，取上清液5 mL，加NaCl 1.4 g 至飽和，渦旋振蕩，加入2 mL二氯甲烷溶劑，渦旋萃取1 min，6000 r/min 離心5 min，取下清液，0.45 μ m 膜過濾，進(jìn)行GC-MS 分析。取4 輪次堆積酒糟（430105）、6 輪次堆積酒糟(6105、694）及大曲（DQB、DQH、DQHuang)作對照，滅菌的麩皮培養(yǎng)基（0）做空白。

復(fù)篩利用高粱糖化液為培養(yǎng)基，接入培養(yǎng)8 h的菌液5 mL，36 ℃±1 ℃，160 r/min 培養(yǎng)9 d。測定風(fēng)味物質(zhì)四甲基吡嗪、糠醛兩種風(fēng)味物質(zhì)含量。

驗(yàn)證試驗(yàn)方法：利用合成培養(yǎng)基與高粱糖化液發(fā)酵；設(shè)置靜置（低氧）與振蕩（高氧）培養(yǎng)方式；前期高溫（40 ℃，3 d），后期低溫（36 ℃，6 d）發(fā)酵。

1.2.3 宏基因組測序分析

利用宏基因組測序分析。

1.2.4 模擬堆積發(fā)酵試驗(yàn)

利用第7 次堆積后的酒糟+高粱進(jìn)行模擬堆積試驗(yàn)。菌種LJ-02 添加到蒸餾取酒后的酒醅中，加入10 %高粱，菌種添加量為2 ‰，置于培養(yǎng)箱模擬堆積發(fā)酵。前3 d 溫度由10 ℃逐漸升至45 ℃，降至35 ℃保持27 d。添加方式分別為：菌液，濾液（0.45 μ m 過濾菌液），菌體（離心，洗滌3次）。

1.2.5 中試車間生產(chǎn)試驗(yàn)

菌種LJ-02接01號(hào)液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)36 h。第二輪蒸酒后，酒糟攤晾，加入酒曲，實(shí)驗(yàn)組加5 ‰菌液，混勻后堆積，溫度升至45 ℃后入窖1 個(gè)月；入窖1 個(gè)月酒糟加入適量糠殼后蒸酒，接酒隨時(shí)測定酒精度，分為頭酒和尾酒，當(dāng)酒精度低于30%vol 時(shí)，更換容器接酒。

1.2.6 企業(yè)釀酒生產(chǎn)試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法：選定1 個(gè)窖池作為實(shí)驗(yàn)窖，按照現(xiàn)有生產(chǎn)工藝（1 窖投糧20 噸，22甑），選擇1 甑堆積糟醅的量作為實(shí)驗(yàn)樣，在堆積后入窖前，對應(yīng)1 甑糟醅900 kg 的量加入9 kg 微生物強(qiáng)化菌劑，入窖置于上層糟醅，待發(fā)酵期結(jié)束后蒸餾取酒。對照樣為現(xiàn)有正常生產(chǎn)窖池生產(chǎn)工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物分離（表1、表2、圖1）

表1 堆積糟醅和高溫大曲樣品分離微生物菌株和計(jì)數(shù)表

圖1 LJ-4-0 和LJ2-4-30 樣品菌落

表2 LJ-4-0 和LJ-4-30 樣品分離微生物菌落形態(tài)

表3 原酒樣品類型和來源

大曲及堆積酒糟中細(xì)菌含量差異不明顯，但堆積酒糟的酵母含量比大曲中高，大曲中霉菌含量比堆積酒糟含量高。

2.2 產(chǎn)醬香風(fēng)味物質(zhì)的菌種篩選

從圖2 可以看出，菌株產(chǎn)四甲基吡嗪及糠醛能力較強(qiáng)，進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。

圖2 菌種發(fā)酵液的4種風(fēng)味物質(zhì)含量

從圖3 可以看出，利用高粱液發(fā)酵產(chǎn)四甲基吡嗪產(chǎn)量低，利用復(fù)合培養(yǎng)基產(chǎn)量高，比試驗(yàn)組高出5 倍多。選取菌種LJ-02、菌種LJ-04、菌種LJ-32、菌種LJ-33 號(hào)菌發(fā)酵復(fù)合培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

圖3 菌種發(fā)酵液的兩種風(fēng)味物質(zhì)含量

從圖4 可以看出，靜置與振蕩條件下4 株菌株四甲基吡嗪產(chǎn)量不一樣，菌種LJ-02 利用合成培養(yǎng)基與高粱糖化液在振蕩條件下產(chǎn)量最高，達(dá)313.8 mg/L。菌株產(chǎn)四甲基吡嗪對含氧條件需求不同，利用高低溫發(fā)酵方式利于四甲基吡嗪產(chǎn)生。

圖4 不同條件下菌種發(fā)酵液的四甲基吡嗪含量

2.3 宏基因組測序分析

選取了大曲、第四次堆積表面糟醅及第四次堆積堆心糟醅3 個(gè)樣品分析其中微生物群落分布，見圖5—圖8。

圖5 細(xì)菌微生物相對豐度圖

圖6 細(xì)菌微生物群落分布圖

圖7 真菌微生物相對豐度圖

圖8 真菌微生物群落分布圖

3 個(gè)樣品細(xì)菌各分類單元在數(shù)量上差異不明顯，厚壁菌門（Fimicutes）、放線菌門(Actinobacteria)與變形菌門（Proteobacteria）是堆積糟醅與大曲的共同優(yōu)勢菌群，但3種優(yōu)勢菌群數(shù)量上的差異極其顯著。大曲中數(shù)量最多的菌群分別為厚壁菌門（Fimicutes）、放線菌門(Actinobacteria)與變形菌門（Proteobacteria），堆積酒糟中數(shù)量最多的菌群分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Fimicutes）與放線菌門(Actinobacteria) 。和堆積酒糟中優(yōu)勢菌群的差異不顯著。

3 個(gè)樣品各真菌分類單元在數(shù)量上差異極其顯著，大曲中各分類單元數(shù)量上最少，其次為堆積中心糟醅，數(shù)量最多的為堆積表面糟醅。3 個(gè)樣品真菌的共同優(yōu)勢種群為子囊菌門(Ascomycota)。

2.4 微生物功能菌劑的試驗(yàn)研究

2.4.1 模擬堆積發(fā)酵試驗(yàn)

由圖9 可知，四甲基吡嗪產(chǎn)量最高為加曲加菌液組，達(dá)到376.4 mg/L，最低為不加曲對照57.9 mg/L。加曲組比不加曲組四甲基吡嗪產(chǎn)量高，加菌種比不加菌種四甲基吡嗪產(chǎn)量高，加濾液比單加菌種四甲基吡嗪產(chǎn)量高，加菌液比單加菌種和濾液四甲基吡嗪產(chǎn)量高（不加曲情況相反），加曲和加菌液對四甲基吡嗪產(chǎn)量有相互促進(jìn)作用。

圖9 菌種LJ-02 模擬堆積發(fā)酵的四甲基吡嗪含量

圖10 菌種LJ-02 中試試驗(yàn)的四甲基吡嗪含量

圖11 實(shí)驗(yàn)及取樣示意圖

2.4.2 中試車間生產(chǎn)試驗(yàn)

經(jīng)中試試驗(yàn)，加菌組比不加菌組四甲基吡嗪含量高，尾酒中四甲基吡嗪含量比頭酒中高，酒體中的四甲基吡嗪含量比酒糟中含量高。添加篩選的菌種LJ-02 比不添加四甲基吡嗪含量高，說明菌種LJ-02 在醬香酒發(fā)酵過程中有助于四甲基吡嗪含量的提升。

2.4.3 企業(yè)釀酒生產(chǎn)試驗(yàn)

對原酒樣品進(jìn)行色譜分析（酯、醇、酸、四甲基吡嗪、糠醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚等），對比分析實(shí)驗(yàn)樣與對照樣的差異。

從表4 可以看出，實(shí)驗(yàn)窖A 上層糟醅（添加9 kg微生物強(qiáng)化菌劑）產(chǎn)酒的乳酸乙酯、四甲基吡嗪含量最高，相比于現(xiàn)有生產(chǎn)工藝，增幅明顯，但糠醛含量有所下降。

表4 釀酒生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)的部分指標(biāo)對比

3 結(jié)論

在醬香型白酒高溫大曲、堆積糟醅分離篩選出產(chǎn)四甲基吡嗪風(fēng)味物質(zhì)的功能性菌種1 株，菌種編號(hào)LJ-02，為芽孢桿菌，耐高溫、耐酸，菌種保藏編號(hào)SICC1.1847。將功能微生物制備成菌劑后進(jìn)行模擬堆積、中試試驗(yàn)、釀酒生產(chǎn)研究，發(fā)現(xiàn)其對四甲基吡嗪含量提高有明顯影響。