余清華 楊亮 楊穎 袁雪金 王宇 張藝嘉 顧盡暉

便秘是一種以排便次數(shù)減少、糞便干硬和(或)排便困難為主要臨床癥狀[1],可作為功能性疾病獨(dú)立存在,也可見(jiàn)于多種器質(zhì)性疾病的常見(jiàn)癥狀。便秘可顯著增加大腸息肉的發(fā)生率,是結(jié)直腸癌潛在的危險(xiǎn)因素[2],是心腦血管意外發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3],且易導(dǎo)致精神心理障礙性疾病的發(fā)生[4]。發(fā)病率高,我國(guó)患病率約8.2%～18%[5],全球高達(dá)14%[6],嚴(yán)重威脅人類(lèi)身心健康。目前便秘治療指南推薦予膳食纖維、各類(lèi)瀉藥、微生態(tài)制劑、促胃腸動(dòng)力藥等治療[7-8],但通常會(huì)產(chǎn)生藥物依耐性、菌群失調(diào)、水電解質(zhì)紊亂等不良反應(yīng)[9]。濟(jì)川煎為明代著名醫(yī)家張景岳所創(chuàng),為“寓通于補(bǔ)之劑”。該方由肉蓯蓉、當(dāng)歸、牛膝、枳殼、升麻、澤瀉6味中藥組成,具有溫腎益精、潤(rùn)腸通便之功。史仁杰教授[10]臨床經(jīng)驗(yàn)豐富,善用溫腎潤(rùn)腸法治療老年性功能性便秘,并取得了顯著臨床療效。多項(xiàng)研究顯示濟(jì)川煎加減治療脾腎兩虛型便秘的有效率高達(dá)90%以上[11-13]。而樂(lè)德[14]和呂靈儀等[15]采用濟(jì)川煎加減治療肺脾氣虛型、脾腎陽(yáng)虛型、陰血虧虛型、陽(yáng)虛腸燥型、腸道氣滯型等多個(gè)證型的便秘患者,其總有效率高達(dá)93.75%～96.4%。同時(shí)有學(xué)者研究證實(shí)濟(jì)川煎加減結(jié)合生物反饋治療脾腎虛弱型出口梗阻型便秘(outlet obstructive constipation,OOC)臨床療效顯著,有效率可達(dá)83.3%～87.10%,可有效改善患者便秘癥狀評(píng)分及焦慮評(píng)分[16-17]。

一項(xiàng)Meta分析研究濟(jì)川煎加減治療便秘的療效,共納入24篇隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(randomized controlled trial,RCT)研究,共2374例便秘患者,分析結(jié)果顯示其有效率、治愈率均明顯高于單純應(yīng)用西藥組,P<0.00001[18];而另一項(xiàng)關(guān)于濟(jì)川煎加減聯(lián)合針灸治療功能性便秘臨床療效Meta分析共納入8篇RCT研究,574例便秘患者,分析結(jié)果顯示其有效率、治愈率均明顯高于單純使用濟(jì)川煎、乳果糖、西沙比利組,P<0.01[19]。老年性便秘以肺脾腎三臟虧虛、功能失調(diào)為基本病機(jī)有關(guān)[20],故臨床應(yīng)用濟(jì)川煎加減治療老年性便秘均可取得顯著療效。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),該兩項(xiàng)Meta分析所納入的研究文獻(xiàn)中,濟(jì)川煎藥物的劑量使用均符合以肉蓯蓉為君,當(dāng)歸、牛膝為臣,枳殼、升麻、澤瀉為佐藥的君臣佐使配伍規(guī)律,這可能是確保濟(jì)川煎臨床療效的關(guān)鍵。

以濟(jì)川煎為基礎(chǔ)方加減治療便秘的臨床療效確切,進(jìn)一步研究其具體分子機(jī)制具有重要意義。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性等特點(diǎn),這與傳統(tǒng)中醫(yī)藥的整體觀、辨證論治十分吻合[21],為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)從經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)向循證醫(yī)學(xué)體系轉(zhuǎn)化提供了新的研究模式[22],且近年來(lái)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用日趨成熟。因此,課題組采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探索濟(jì)川煎治療便秘的可能作用機(jī)制,并通過(guò)拓?fù)鋵W(xué)分析深入研究有效活性成分、靶基因的分布規(guī)律與君臣佐使配伍特點(diǎn)之間的關(guān)系,有望初步揭示濟(jì)川煎藥物君臣佐使配伍協(xié)同增效治療便秘的可能作用機(jī)制,為進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)[23](https://tcmspw.com/tcmspsearch.php),聯(lián)合蛋白質(zhì)序列(The Universal Protein Resource,Uniprot)數(shù)據(jù)庫(kù)[24](https://www.uniprot.org),功能蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)(STRING)數(shù)據(jù)庫(kù)[25](https://string-db.org),人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)[26](GeneCards)(https://www.genecards.org),治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)[27](Therapeutic Target Database,TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/),人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)[28](Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://www.omim.org),Venny2.1.0在線軟(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)[29](https://metascape.org),“微生信”在線作圖軟件(http://www.bioinformatics.com.cn),分析和編輯軟件(Cytoscape 3.8.0),Excel軟件。

1.2濟(jì)川煎藥物有效成分、靶基因的篩選

通過(guò)TCMSP平臺(tái),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類(lèi)藥性(drug-likeness,DL)≥0.18[30]為篩選條件,以肉蓯蓉、當(dāng)歸、牛膝、枳殼、升麻、澤瀉為檢索詞,獲取對(duì)應(yīng)有效活性成分、靶蛋白。借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù),條件設(shè)置為“Reviewed”,生物種屬設(shè)置為“homo sapiens(human)”,獲得靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3便秘靶基因的篩選

采用GeneCards、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù),以“constipation”“Functional constipation”“idiopathic colonic constipation”為檢索詞,限制檢索條件為“gene”與“homo sapiens”進(jìn)行檢索,收集、除重后獲得便秘相關(guān)靶蛋白,并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)相關(guān)靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.4“藥物—疾病”交集基因的獲取

采用Venny2.1.0在線軟件,將標(biāo)準(zhǔn)化處理后的藥物、便秘靶基因?qū)牒螳@得濟(jì)川煎治療便秘的潛在作用靶基因。

1.5“藥物—活性成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Excel軟件構(gòu)建“藥物—活性成分—靶點(diǎn)”的Type文件和Network文件,將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件繪制“藥物—活性成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,使用其內(nèi)置工具Network Analyzer計(jì)算出節(jié)點(diǎn)度(Degree值),根據(jù)2倍Degree值中位數(shù)篩選出核心有效活性成分。

1.6蛋白互作(protein protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶基因的獲取

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù),條件設(shè)置為“Multiple proteins”、物種選擇“homo sapiens”,設(shè)置中置信度“medium confidence”為0.4,其余設(shè)置均為默認(rèn)值。分別導(dǎo)入藥物靶基因及交集靶基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)互作,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將所獲得的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?篩選大于Degree值中位數(shù)的靶基因作為潛在核心靶基因并將其可視化。

1.7GO功能富集分析、KEGG通路富集分析及其可視化

采用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶基因進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,將獲得的數(shù)據(jù)通過(guò)“微生信”在線作圖軟件進(jìn)行可視化分析。構(gòu)建“藥物—活性成分—靶點(diǎn)-信號(hào)通路”的Type文件和Network文件,將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行分析并將其可視化。

1.8分子對(duì)接

將PPI網(wǎng)絡(luò)分析中degree值排名靠前的靶蛋白(受體)與其所對(duì)應(yīng)的活性成分(配體)進(jìn)行分子對(duì)接。活性成分結(jié)構(gòu)通過(guò)TCMSP平臺(tái)獲取,保存為mol2格式,并將其導(dǎo)入Autodock Vina進(jìn)行加氫、加電荷等處理后保存為pdbqt格式;靶蛋白結(jié)構(gòu)通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org)獲取,首選具有自身配體且配體與小分子結(jié)構(gòu)相似的蛋白結(jié)構(gòu),保存為PDB格式并導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行去除水分子、分離小分子等處理;利用靶蛋白與自身配體獲得分子對(duì)接的空間位點(diǎn);將獲得的受體與相應(yīng)的配體通過(guò)Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接,將結(jié)果導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)一步處理并將其可視化。

2 結(jié)果

2.1濟(jì)川煎藥物有效成分、靶點(diǎn)篩選與整合

通過(guò)上述研究,獲得藥物活性成分37個(gè),肉蓯蓉6個(gè)、當(dāng)歸2個(gè)、牛膝16個(gè)、枳殼5個(gè)、升麻8個(gè)、澤瀉7個(gè)。其中槲皮素為肉蓯蓉、牛膝共有活性成分;β-谷固醇為肉蓯蓉、當(dāng)歸、牛膝、枳殼共有活性成分;豆甾醇為當(dāng)歸、牛膝、升麻共有活性成分;谷甾醇是升麻、澤瀉的共同有效活性成分。獲得有效活性成分對(duì)應(yīng)靶基因233個(gè),其中肉蓯蓉165個(gè)、當(dāng)歸50個(gè)、牛膝198個(gè)、枳殼85個(gè)、升麻50個(gè)、澤瀉5個(gè)。濟(jì)川煎藥物間存在交互靶基因,以肉蓯蓉、牛膝最為明顯。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 濟(jì)川煎6味藥物靶基因分布情況

表1 濟(jì)川煎6味中藥交互靶基因情況

2.2便秘靶點(diǎn)整合

采用GeneCards、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù),以“constipation”“Functional constipation”“idiopathic colonic constipation”為檢索詞,限制檢索條件、去除重復(fù)項(xiàng)及經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后共獲得便秘靶基因6246個(gè)(見(jiàn)表2)。

表2 便秘靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表

2.3交集基因獲取

通過(guò)“Venny2.1.0”在線軟件,獲得“濟(jì)川煎—便秘”的共同靶基因共182個(gè)(如圖2)。

圖2 濟(jì)川煎藥物靶基因與便秘靶基因Venn圖

2.4“藥物—活性成分—靶基因網(wǎng)絡(luò)”分析

通過(guò)構(gòu)建“藥物—活性成分—靶基因”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析(網(wǎng)絡(luò)關(guān)系見(jiàn)圖3),獲得276個(gè)節(jié)點(diǎn),919條邊,Degree值中位數(shù)為3,大于2倍Degree值中位數(shù)的有效成分21個(gè)。見(jiàn)表3。

注:節(jié)點(diǎn)越大,表示度值越大,網(wǎng)絡(luò)中越處于核心地位,中心的藍(lán)色圖標(biāo)表示基因,周?chē)G色圖標(biāo)表示藥物,其余為有效成分。

表3 21個(gè)核心活性成分信息表

2.5濟(jì)川煎復(fù)方靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)

將上述獲得的濟(jì)川煎復(fù)方233個(gè)靶基因數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)上述條件設(shè)置、分析后獲得節(jié)點(diǎn)數(shù)233個(gè),4404條邊,平均節(jié)點(diǎn)度37.8,PPI富集P值:<1.0e-16的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(見(jiàn)圖4)。將獲得的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件,通過(guò)計(jì)算得出Degree值中位數(shù)為149,Degree值≥149的靶基因35個(gè)。其中肉蓯蓉28個(gè)、當(dāng)歸4個(gè)、牛膝30個(gè)、枳殼14個(gè)、升麻6個(gè)、澤瀉0個(gè)。見(jiàn)表4。

圖4 濟(jì)川煎復(fù)方靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表4 濟(jì)川煎復(fù)方35個(gè)Degree值≥149的靶基因信息表

2.6藥物—疾病交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將182個(gè)藥物—疾病交集靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)分析獲得PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件。將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件,使用其內(nèi)置工具Network Analyzer計(jì)算,獲得182個(gè)節(jié)點(diǎn),3607條邊,Degree值中位數(shù)為66。取Degree值≥66的靶基因作為潛在核心靶基因并構(gòu)建PPI可視化網(wǎng)絡(luò)圖。其中藥物潛在核心靶基因AKT1、TP53、TNF、IL6、JUN、VEGFA、CASP3均位列前8,IL1B位列第21位。見(jiàn)圖5、表5。

從表2看出，在8個(gè)主要性狀中，除穗粒數(shù)外，全生育期、有效穗、株高、穗長(zhǎng)、實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重全部與產(chǎn)量呈不顯著正相關(guān)，其中，有效穗、結(jié)實(shí)率、實(shí)粒數(shù)與產(chǎn)量相關(guān)性較大，說(shuō)明容易通過(guò)增加單位面積有效穗而增加最終產(chǎn)量。

注:顏色越深,圖標(biāo)越大其度值越大,其中處于網(wǎng)絡(luò)中心的均為度值大于90的靶點(diǎn)。

表5 37個(gè)“藥物—疾病交集核心靶基因”信息表

2.7GO功能富集分析、KEGG通路富集分析及其可視化

通過(guò)GO功能富集分析,獲得具有顯著意義(P<0.01)的BP條目共1428條,包括蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、MAPK級(jí)聯(lián)、對(duì)細(xì)胞分化調(diào)控等;CC條目62條,包括細(xì)胞膜、胞質(zhì)囊腔、細(xì)胞外基質(zhì)等;MF條目共97條,包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、調(diào)節(jié)激酶活性等;分別將BP、CC、MF的前10條條目進(jìn)行可視化。見(jiàn)圖6。

圖6 GO功能富集分析中分別富集在BP、CC、MF上的基因數(shù)目排名前10的條目可視化圖

2.8KEGG信號(hào)通路分析

通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析,共獲得癌癥信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等219條信號(hào)通路,具有顯著意義(P<0.01)的信號(hào)通路有169條。將最具顯著意義的前20條通路條目進(jìn)行可視化。見(jiàn)圖7。

圖7 KEGG通路富集分析獲得的根據(jù)log(P)值排序前20條通路可視化圖

2.9構(gòu)建“藥物—有效成分—靶基因—通路”網(wǎng)絡(luò)

對(duì)log(P)值排序前20條通路對(duì)應(yīng)的靶基因、有效成分及藥物導(dǎo)入Excel軟件構(gòu)建“藥物—活性成分—靶基因—信號(hào)通路”的Type文件和Network文件,并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件。通過(guò)計(jì)算、分析后獲得176個(gè)節(jié)點(diǎn),1106條邊的網(wǎng)絡(luò)可視化圖(見(jiàn)圖8)。進(jìn)一步拓?fù)鋵W(xué)分析,獲得Degree值排名前五的有效成分有:槲皮素、β-谷固醇、豆甾醇、山奈酚、漢黃芩素;Degree值排名前20的靶基因有:PTGS2、RELA、AKT1、CASP3、BAX、BCL2、CASP9、JUN、TP53、CHUK、IKBKB、MAPK1、CCND1、CASP8、MAPK3、MAPK8、TNF、IL6、NFKBIA、CDKN1A,包含濟(jì)川煎藥物及交集靶基因的共同潛在核心靶基因AKT1、TP53、TNF、IL6、JUN、CASP3,且均富集在MAPK信號(hào)通路上(見(jiàn)表6),濟(jì)川煎6味藥物除澤瀉外,均參與MAPK信號(hào)通路。見(jiàn)表7。

表6 AKT1、TP53、TNF、IL6、JUN、CASP3在6條通路上的富集情況

表7 濟(jì)川煎6味不同中藥參與6條主要信號(hào)通路概況表

2.10分子對(duì)接

在分子對(duì)接中,當(dāng)結(jié)合能小于0 kcal/mol時(shí)配體和受體之間可以自發(fā)結(jié)合,且結(jié)合能越小,結(jié)合越穩(wěn)定[31-32]。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值大于90的14個(gè)核心靶點(diǎn)(AKT1、TP53、IL6、MAPK3、TNF、VEGFA、CASP3、JUN、EGF、MAPK8、EGFR、MAPK1、MYC、PTGS2)與其對(duì)應(yīng)的有效成分通過(guò)Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果表明:除PTGS2與其對(duì)應(yīng)的其中4個(gè)有效成分對(duì)接不成功外,其余對(duì)接結(jié)果良好,結(jié)合能均≤-3.51 kcal/mol(見(jiàn)表8),且均能形成氫鍵。其中AKT1、TP53與quercetin的對(duì)接效果最好,將其導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行視覺(jué)優(yōu)化,quercetin分別與氨基殘基(AKT1中的ASN-54、LYS-179,TP53中的SER-190、ASN-214)形成氫鍵作用,其鍵長(zhǎng)如圖中所示。見(jiàn)圖9、圖10。

圖9 AKT1與quercetin對(duì)接模型可視化圖

圖10 EGFR與quercetin對(duì)接模型可視化圖

表8 14個(gè)核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)有效成分對(duì)接分?jǐn)?shù)一覽表

3 討論

對(duì)君臣佐使的論述目前尚無(wú)統(tǒng)一定論。張?jiān)靥岢觥傲Υ笳邽榫?同時(shí)也提出“為君最多,臣次之,佐使又次之”[41]。李東垣繼承張?jiān)氐膶W(xué)術(shù)思想,在《脾胃論》中記載:“君藥分量最多,臣藥次之,使藥又次之。”李園白等[42]將2022首方劑劑量與君臣佐使關(guān)系進(jìn)行研究,結(jié)論顯示君臣在處方中劑量最大。而李飛教授[43]提出的“主病之謂君”是前提、“力大者為君”是其補(bǔ)充較為切合,更符合方劑組方原則和臨床處方規(guī)律。

3.1潛在核心有效活性成分與君臣佐使

通過(guò)上述研究,共獲得濟(jì)川煎復(fù)方潛在活性成分37個(gè),肉蓯蓉6個(gè)、當(dāng)歸2個(gè)、牛膝16個(gè)、枳殼5個(gè)、升麻8個(gè)、澤瀉7個(gè)。其中槲皮素為肉蓯蓉、牛膝共有活性成分;β-谷固醇為肉蓯蓉、當(dāng)歸、牛膝、枳殼共有活性成分;豆甾醇為當(dāng)歸、牛膝、升麻共有活性成分;谷甾醇是升麻、澤瀉的共同有效活性成分。潛在核心有效活性成分21個(gè)(見(jiàn)表3),其中Degree值前五的是槲皮素、β-谷固醇、豆甾醇、山奈酚、漢黃芩素,而山奈酚、漢黃芩素均為牛膝的主要活性成分。因此,濟(jì)川煎潛在核心有效活性成分的分布規(guī)律與君臣佐使配伍特點(diǎn)吻合。

其中槲皮素具有穩(wěn)定肥大細(xì)胞、防止組胺釋放及調(diào)節(jié)腸道菌群[44],同時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)mAChRs及其下游信號(hào)及其水通道蛋白來(lái)介導(dǎo)SD大鼠便秘中的胃腸蠕動(dòng)、粘蛋白分泌及腸道水液的調(diào)節(jié),進(jìn)而改善腸蠕動(dòng)功能及糞便含水量[45-46],通過(guò)抑制炎癥和上額皮質(zhì)中BDNF/TrKβ/β-catenin軸[47]及BDNF-AKT/ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路[48]來(lái)發(fā)揮抗抑郁、抗腫瘤和心臟保護(hù)作用。β-谷甾醇具有抗焦慮、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)微生物、抗糖尿病、降脂、抗腫瘤等作用[49-50]。豆甾醇可活化c-Junn-末端激酶(JNK)[51],而AQP3蛋白表達(dá)與JNK/MAPK信號(hào)的調(diào)控有關(guān)[52],從而參與水液代謝的調(diào)節(jié);且可通過(guò)調(diào)控JNK信號(hào)通路可抑制炎癥和細(xì)胞凋亡,從而可能起到神經(jīng)保護(hù)及調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[53]。山奈酚具有保護(hù)內(nèi)臟、擴(kuò)張血管、解痙[54]作用,具有抑制神經(jīng)元凋亡及促進(jìn)神經(jīng)再生功能[55],對(duì)抑郁癥患者還可降低血漿中NO 的表達(dá)水平[56],而NO低表達(dá)對(duì)大便的性狀起決定性作用[57],高NO可抑制結(jié)腸平滑肌收縮而引起STC的發(fā)生[57]。漢黃芩素可通過(guò)PI3K調(diào)節(jié)自噬和炎癥,減少糖尿病小鼠的腎小管損傷[58];還可通過(guò)AKT/GSK3β上調(diào)MSC中的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α信號(hào)通路,提高IL-10的表達(dá)水平而發(fā)揮炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的治療作用[59]。

3.2潛在核心靶基因與君臣佐使

通過(guò)研究,獲得濟(jì)川煎復(fù)方潛在核心靶基因35個(gè)(見(jiàn)表4),交集潛在核心靶基因37個(gè)(見(jiàn)表5),其中AKT1、TP53、TNF、IL6、JUN、VEGFA、CASP3是濟(jì)川煎復(fù)方潛在核心靶基因Degree值前7,交集潛在核心靶基因Degree值前8的共同靶基因。其中AKT1、TP53、TNF、IL6、JUN、VEGFA、CASP3均為肉蓯蓉、牛膝共同靶基因;AKT1、TP53、JUN、CASP3為枳殼,TNF、IL6為升麻,JUN、CASP3為當(dāng)歸的共同靶基因。說(shuō)明濟(jì)川煎潛在核心靶基因的分布規(guī)律與君臣佐使配伍特點(diǎn)一致。

其中AKT1可通過(guò)一系列酶促反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)新陳代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管生成等多種生物功能[60],抑制NF-κB的活性可發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌代謝等作用[61];而Akt失調(diào)可能與癌癥、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及精神異常等嚴(yán)重疾病的發(fā)生有關(guān)[62]。TP53可通過(guò)刺激BAX和FAS抗原表達(dá)或通過(guò)抑制Bcl-2表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)凋亡,而通過(guò)與PPP1R13B/ASPP1或TP53BP2/ASPP2[63]的相互作用激活其促凋亡活性。IL6可通過(guò)“反式傳遞”并與IL1B和TNF協(xié)同誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生,而VEGF直接或間接地在血管生成活性和血管通透性中發(fā)揮作用[64],同時(shí)還參與代謝控制,增加脂解作用并改善胰島素抵抗[65]。Jun包括c-Jun、JunB、JunD[66],而AP-1家族成員包括Jun亞家族及ATF2、ATF7和ATF3,Jun/ATF型復(fù)合物是活化B細(xì)胞型彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系增殖的重要驅(qū)動(dòng)因素[67],在惡性腫瘤中促進(jìn)自分泌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[68]。CASP3可促進(jìn)凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸暴露外[69],還具有增殖、神經(jīng)元導(dǎo)航、遷移和分化等多種細(xì)胞機(jī)制[70]。轉(zhuǎn)錄因子MYC與VEGFA啟動(dòng)子結(jié)合后可促進(jìn)VEGFA的產(chǎn)生和隨后的血管生成[71]。因此,這7個(gè)潛在核心靶基因可能為濟(jì)川煎復(fù)方潛在核心有效活性成分與之結(jié)合而發(fā)揮君臣佐使協(xié)同增效作用,在便秘、腫瘤、心腦血管疾病、代謝性疾病中發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶基因。

3.3MAPK信號(hào)通路與君臣佐使

對(duì)“藥物—有效成分—靶基因—通路”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn),Degree值前20中包括前期篩選的AKT1、TP53、TNF、IL6、JUN、CASP3潛在核心靶基因,且均富集在MAPK信號(hào)通路上(見(jiàn)表6)。且分子對(duì)接顯示結(jié)合性好,結(jié)合穩(wěn)定,其中槲皮素的對(duì)接分?jǐn)?shù)最高(見(jiàn)表8)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),濟(jì)川煎6味藥物中除澤瀉外,其余5味藥均參與這條通路(見(jiàn)表7)。因此課題組認(rèn)為MAPK信號(hào)通路可能為濟(jì)川煎治療便秘及預(yù)防、治療腫瘤、心腦血管等疾病的主要信號(hào)通路。

MAPK信號(hào)通路包括ERK1/2、p38、JNK和ERK5四個(gè)家族成員[72],具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等多種生物活性,在便秘、炎癥、心衰、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[73],其網(wǎng)絡(luò)關(guān)系十分復(fù)雜。ICC為傳遞腸神經(jīng)元興奮及抑制性信號(hào),參與控制腸道運(yùn)動(dòng)等功能[74],ICC的缺少及網(wǎng)絡(luò)完整性的改變都可致結(jié)腸動(dòng)力減弱而發(fā)生STC。目前研究表明,雌激素可能通過(guò)活化ICC內(nèi)的ERK1/2蛋白激酶后而抑制ICC的生長(zhǎng)、增殖及功能改變[75],從而導(dǎo)致女性STC的發(fā)生。而SP具有興奮腸道平滑肌、增強(qiáng)腸道蠕動(dòng)、減少腸道水分吸收及參與細(xì)胞修復(fù)等多種生物學(xué)功能[76-77]。研究顯示,SP可以抑制JNK的表達(dá)[78],而抑制JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路可下調(diào)AQP3蛋白表達(dá)水平[79]。萬(wàn)葉敏等[80]研究顯示,抑制PKA/MPKA信號(hào)通路可抑制AQP3、AQP4水通道蛋白的表達(dá)。而耿學(xué)斯等[81]研究顯示,激活p38MAPK信號(hào)通路可抑制AQP3、促進(jìn)AQP9表達(dá)。除此之外,PI3K-Akt信號(hào)通路與STC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[82-83],還與潰瘍性結(jié)腸炎、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[84-85]。cAMP-PKA信號(hào)通路為MAPK信號(hào)通路的上游通路,結(jié)合課題組前期的研究,濟(jì)川煎可通過(guò)抑制cAMP-PKA/MAPK信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)君臣佐使間協(xié)同增效作用,促進(jìn)ICC生長(zhǎng)、抑制AQP3、AQP4表達(dá)等多種生物功能。而TNF/PI3K-Akt信號(hào)通路為MAPK的上游信號(hào)通路,p53信號(hào)通路為其下游通路,AKT1、TNF、IL6、CASP3是上游基因,TP53、JUN是下游基因,濟(jì)川煎能否通過(guò)激活或是抑制其活性而在便秘、腫瘤、心腦血管、代謝性等疾病中發(fā)揮作用,尚需進(jìn)一步研究闡明。

經(jīng)上述研究,初步闡明了濟(jì)川煎治療便秘的可能分子機(jī)制,初步從分子水平認(rèn)識(shí)濟(jì)川煎君臣佐使配伍協(xié)同增效機(jī)制。濟(jì)川煎君臣佐使藥效機(jī)制可能為:君藥肉蓯蓉主要通過(guò)槲皮素、β-谷固醇作用于AKT1、TP53、TNF、IL6、JUN、VEGFA、CASP3、IL1B等靶蛋白;臣藥牛膝通過(guò)槲皮素、β-谷固醇、山奈酚、漢黃芩素、豆甾醇作用于AKT1、TP53、TNF、IL6、JUN、VEGFA、CASP3、IL1B等靶蛋白,當(dāng)歸通過(guò)β-谷固醇、豆甾醇作用于JUN、CASP3等靶蛋白;佐藥枳殼通過(guò)β-谷固醇作用于AKT1、TP53、JUN、CASP3等靶蛋白,升麻通過(guò)豆甾醇、谷甾醇作用于TNF、IL6等靶蛋,澤瀉通過(guò)谷甾醇作用于NCOA2等對(duì)應(yīng)靶蛋白來(lái)調(diào)控MAPK等信號(hào)通路,通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路通路協(xié)同增強(qiáng)君臣佐使功效,從而發(fā)揮便秘的治療及可能在腫瘤、心腦血管、代謝性等疾病中的預(yù)防、治療作用。但基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性,經(jīng)本研究篩選出的核心有效成分、核心靶點(diǎn)、通路及君臣佐使配伍協(xié)同增效機(jī)制,尚需進(jìn)一步通過(guò)大量高質(zhì)量的臨床、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及更多分子生物學(xué)研究予以驗(yàn)證、補(bǔ)充。