亓 凱,劉芊伊,劉利萍,蒙祖迪,衛(wèi)麟娜,高雪涵,宋 濤,羅軍敏

(遵義醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞,在抗病原微生物、抗腫瘤、炎癥損傷中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。近年來(lái),巨噬細(xì)胞在感染免疫過(guò)程中所發(fā)揮的作用成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。巨噬細(xì)胞在不同誘導(dǎo)刺激下可產(chǎn)生極化,從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的表型和功能的可塑性與異質(zhì)性。目前根據(jù)其狀態(tài)和功能的不同分為:經(jīng)典活化型(M1)和替代活化型(M2)［1]。M1型巨噬細(xì)胞由IFN-γ、脂多糖等Th1型細(xì)胞因子誘導(dǎo)而來(lái),分泌大量的炎癥因子,如IL-1、NO等;M2型巨噬細(xì)胞由IL-4、IL-13等Th2型細(xì)胞因子誘導(dǎo)活化,分泌抗炎因子,如IL-10、TGF-β等［2]。當(dāng)機(jī)體受到感染或炎癥等理化因素刺激時(shí),巨噬細(xì)胞多表現(xiàn)出 M1表型,釋放 TNF-α,IL-1β等因子來(lái)發(fā)揮固有免疫功能;因此,機(jī)體調(diào)控產(chǎn)生M2型巨噬細(xì)胞分泌大量的 IL-10和 TGF-β 等發(fā)揮免疫抑制功能,促進(jìn)組織修復(fù)、血管生成和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［3-4]。巨噬細(xì)胞可根據(jù)其不同的表型來(lái)發(fā)揮相應(yīng)的功能,針對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控策略可成為感染性疾病臨床治療新的切入點(diǎn)［5]。

貓爪草(ranunculi ternati radix, RTR)為毛莨科植物小毛莨的塊根,功能主治化痰散結(jié),解毒消腫［6]。近年來(lái)研究表明貓爪草具有抗腫瘤、抗結(jié)核以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的藥理作用［7-9]。研究表明,貓爪草治療淺表淋巴結(jié)結(jié)核的效果較好,不良反應(yīng)發(fā)生率較低［10]。楊牧之等［11]研究發(fā)現(xiàn)貓爪草提取物可以提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活性,從而影響機(jī)體的免疫效應(yīng)。也有研究顯示貓爪草可提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能從而加強(qiáng)免疫活性［12]。目前有關(guān)貓爪草的相關(guān)免疫作用機(jī)制尚未闡明,是否影響巨噬細(xì)胞極化尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)用貓爪草醇類(lèi)提取物體外刺激小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages, BMDM),檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),鑒定巨噬細(xì)胞的極化表型,為貓爪草進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 RTR醇類(lèi)提取物購(gòu)于小草植物科技有限責(zé)任公司,原產(chǎn)地廣西,批號(hào):XC20151205,規(guī)格:10∶1。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠,6～8周,雌性,購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)所用試劑 DMEM培養(yǎng)基和FBS購(gòu)于Gibco公司;小鼠重組GM-CSF購(gòu)于Peprotech公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄、qPCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司;PCR引物合成由生工生物工程公司完成;IL-10、iNOS、TGF-β和TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自eBioscience 公司。

1.4 獲取BMDM 6～8周大的BABL/C小鼠,取股骨及脛骨骨髓細(xì)胞,用DMEM完全培養(yǎng)基(含有20 ng/mL GM-CSF),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)7 d,收集貼壁細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80和CD11b表達(dá)情況鑒定體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的純度。

1.5 CCK8檢測(cè)BMDM活性 收集培育7 d的BMDM,密度為每孔3×104個(gè)鋪于96孔板中,孵育箱培養(yǎng)24 h使其貼壁,將10、50、100、150、200、500 μg/mL不同濃度RTR誘導(dǎo)BMDM 24 h,并設(shè)空白對(duì)照孔,每組3個(gè)復(fù)孔。CCK8檢測(cè)BMDM的活性。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)BMDM細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平 收集BMDM,TRIzol法提取總RNA,按照TaKaRa說(shuō)明書(shū)所述,以總RNA為模板,將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。以cDNA為模板構(gòu)建qRT-PCR反應(yīng)體系,95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.7 ELISA檢測(cè)BMDM細(xì)胞因子的分泌水平 收集細(xì)胞的培養(yǎng)上清,用ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-10、TGF-β細(xì)胞因子的分泌。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加樣,置于37 ℃溫育60 min,加入稀釋30倍的洗滌液洗板5次,加顯色劑A、B,37 ℃避光顯色5～15 min后加入終止液,終止反應(yīng)。450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(OD)值并檢測(cè)細(xì)胞因子濃度。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMDM細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá) 取BMDM,收集于流式管中,分別加入F/480抗體、NOS2抗體與CD206抗體各1 μL,4 ℃避光共孵育30 min,洗去游離的抗體,重懸后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)NOS2與CD206的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 RTR醇類(lèi)提取物對(duì)BMDM活性及形態(tài)的影響 細(xì)胞培養(yǎng)7 d后,F480+/CD11b+陽(yáng)性率達(dá)90.6%,鑒定為BMDM(圖1A);以不同濃度梯度RTR刺激BMDM 24 h,CCK-8檢測(cè)其活性變化,確定100 μg/mL的RTR為后續(xù)實(shí)驗(yàn)最佳的刺激濃度(圖1B);RTR刺激BMDM 24 h后,光鏡下觀察巨噬細(xì)胞為梭狀、偽足較長(zhǎng),呈M1型,未刺激組的M0型巨噬細(xì)胞呈橢圓形(圖1C)。

A:FCM檢測(cè)BMDM細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá);B:CCK-8檢測(cè)RTR醇類(lèi)提取物刺激BMDM最佳濃度;C:光鏡下觀察BMDM、RTR醇提取物形態(tài)變化,×20;*、**:與對(duì)照組比較,P<0.05、P<0.01;n=3。

2.2 RTR醇類(lèi)提取物對(duì)BMDM細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響 分別用IFN-γ、IL-4、RTR 刺激BMDM 0、12、24、36、48、72 h,RTR醇類(lèi)提取物組與對(duì)照組相比,M1型標(biāo)志物IL-6、iNOS、TNF-α的mRNA表達(dá)水平升高(圖2A)。另一方面,M2型標(biāo)志物IL-10、Arg-1、TGF-β的表達(dá)水平降低(圖2B)。

*、**:與對(duì)照組比較,P<0.05、P<0.001;n=3。

2.3 RTR醇類(lèi)提取物對(duì)BMDM細(xì)胞因子分泌水平的影響 RTR刺激BMDM 48 h后檢測(cè)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的表達(dá),與M0型巨噬細(xì)胞相比TNF-α、iNOS相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加(圖3A、B)。TGF-β、IL-10相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(P<0.05,圖3C、D)。表明RTR刺激后的BMDM與M1型極化相關(guān)。

*、**:與對(duì)照組比較,P<0.05、P<0.01;n=3。

2.4 RTR醇類(lèi)提取物對(duì)BMDM 極化相關(guān)膜分子表達(dá)的影響 RTR醇類(lèi)提取物刺激BMDM后,F4/80+NOS2+細(xì)胞占比隨刺激時(shí)間逐漸升高,于36 h達(dá)到峰值,F4/80+CD206+細(xì)胞占比未發(fā)生明顯改變,表明BMDM發(fā)生M1型極化(圖4)。

3 討論

根據(jù)不同的微環(huán)境,巨噬細(xì)胞可分化為 M1、M2兩種不同的表型。M1型巨噬細(xì)胞又被稱(chēng)為經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage),激活后分泌活性氧中間產(chǎn)物和還原性一氧化氮合酶等大量的炎性細(xì)胞因子,促進(jìn)炎癥的發(fā)展,從而清除病原體,調(diào)節(jié)并促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答;M2型巨噬細(xì)胞被稱(chēng)為替代激活的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage),激活后高表達(dá)炎癥抑制因子,抑制炎癥反應(yīng),促進(jìn)組織修復(fù)等［13]。因此,探索巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)機(jī)制有利于闡明疾病的發(fā)生發(fā)展,為臨床用藥提供理論支持。近年來(lái)有大量研究報(bào)道中草藥及其活性成分對(duì)巨噬細(xì)胞的影響,從而揭示巨噬細(xì)胞極化與治療疾病的關(guān)聯(lián)［14-16]。貓爪草是我國(guó)民間用于抗結(jié)核的傳統(tǒng)藥物,對(duì)于結(jié)核分枝桿菌具有明顯的抑制作用［17-18]。研究表明貓爪草可以抑制結(jié)核桿菌生長(zhǎng),促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α［19]。但目前研究中貓爪草是否能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞表型、功能改變未見(jiàn)報(bào)道。

為了明確RTR的免疫功能與機(jī)制,本研究采用RTR醇類(lèi)提取物誘導(dǎo)BMDM,觀察RTR醇類(lèi)提取物與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)聯(lián)。首先從形態(tài)學(xué)觀察,M0型巨噬細(xì)胞以圓形、橢圓形為主,RTR醇類(lèi)提取物誘導(dǎo)后,細(xì)胞形態(tài)呈梭狀且偽足較長(zhǎng),與 M1型巨噬細(xì)胞形態(tài)相近。進(jìn)一步檢測(cè)RTR醇類(lèi)提取物誘導(dǎo)后 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)mRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)M1型極化相關(guān)IL-6、iNOS、TNF-α的mRNA表達(dá)顯著上調(diào),且M2型極化相關(guān)IL-10、Arg1、TGF-β的 mRNA表達(dá)明顯下調(diào);另一方面ELISA結(jié)果顯示TNF-α、iNOS的分泌明顯增加,而TGF-β、IL-10的分泌降低。上述結(jié)果表明,貓爪草可以刺激M1型極化相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與分泌,與文獻(xiàn)報(bào)道的M1型巨噬細(xì)胞極化后的功能相符合［20]。為了明確貓抓草刺激后BMDM極化表型的改變,通過(guò)FCM檢測(cè)極化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),發(fā)現(xiàn)M1型極化相關(guān)標(biāo)志物NOS2表達(dá)在RTR誘導(dǎo)36 h后明顯升高,而M2型極化相關(guān)標(biāo)志物CD206無(wú)明顯變化,表明貓抓草具有刺激BMDM向M1型極化的活性。

基于貓爪草調(diào)節(jié)免疫功能的優(yōu)勢(shì),本研究發(fā)現(xiàn)貓爪草醇類(lèi)提取物能夠誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞極化。為貓爪草相關(guān)研究明確了其抗結(jié)核、抗腫瘤相關(guān)藥理藥效,并為進(jìn)一步研發(fā)貓爪草制劑在臨床疾病的防治及應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。