玉結(jié)珍，楊紅梅，趙清鴻，王柳乂，秘嘯然

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西南寧 530001

2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 廣西南寧 530011

支氣管擴(kuò)張癥對(duì)應(yīng)中醫(yī)診斷學(xué)“肺癰”“咳嗽”“咯血”等內(nèi)容，中醫(yī)經(jīng)典《諸病源候論·肺癰候》認(rèn)為該病因寒邪侵襲肺，與血液相搏，結(jié)成了癰，再加上熱邪積聚，遂形成了膿。有學(xué)者認(rèn)為本病以陰虛為本，邪熱為標(biāo)，主張清肺化痰、清火養(yǎng)陰為主。廣西名中醫(yī)陳斯寧教授創(chuàng)立的科內(nèi)協(xié)定處方清肺化痰湯，方藥組成及劑量如下：桑白皮、黃芩、瓜蔞殼、浙貝母、杏仁、蘇子、半夏、茯苓各10g，魚腥草20g，瓜蔞仁、甘草各6g，有止咳平喘、清肺化痰功效，方中主藥桑白皮、黃芩能起到清瀉肺熱作用；浙貝母、瓜蔞殼、魚腥草、瓜蔞仁化痰清熱，是不可或缺的輔藥；作為重要的佐藥杏仁、半夏、蘇子降氣化痰平喘，茯苓可以健脾滲濕，與甘草祛痰止咳。多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)清肺化痰湯可以降低慢阻肺痰熱壅肺證急性發(fā)作患者的C反應(yīng)蛋白，改善肺通氣功能，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）以及各類血清炎癥因子等的表達(dá)受到抑制，使氣道炎癥得到控制，還能降低患者血清丙二醛（MDA）水平、升高超氧化物歧化酶（SOD）水平，達(dá)到提高抗氧化能力的作用[1-4]。

支氣管-肺組織感染以及支氣管的阻塞是支氣管擴(kuò)張癥的重要病理因素，治療該病最主要是控制其炎癥反應(yīng)[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)多種數(shù)據(jù)庫(kù)搜索出方藥的多種有效成分、藥物與疾病的核心基因，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，最終剖析藥物作用于疾病的生物過(guò)程和作用通路，從而闡明藥物從多種途徑和多個(gè)靶點(diǎn)治療疾病的作用機(jī)制[6]。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，研究清肺化痰湯藥物中多個(gè)有效成分治療支擴(kuò)的作用機(jī)理，尋找出清肺化痰湯治療慢性呼吸系統(tǒng)疾病的新靶點(diǎn)、新通絡(luò)。

研究方法

1 清肺化痰湯活性成分以及作用靶基因的選擇

清肺化痰湯活性成分通過(guò)中藥數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲取，選出生物口服利用度OB≥30%并且類藥性分析DL≥0.18的活性成分，為得到藥物活性成分靶基因，翻閱相關(guān)資料，去掉沒(méi)有相應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分，最后獲得的基因在UniProt進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，為下一步構(gòu)建藥物與疾病網(wǎng)絡(luò)做準(zhǔn)備。

2 清肺化痰湯活性成分和靶基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用得到的清肺化痰湯有效成分及標(biāo)準(zhǔn)化后的靶基因，制作Network和Type表格，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件上，構(gòu)建藥物活性成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置Degree值，遴選出重要活性成分。

3 獲取支氣管擴(kuò)張癥相關(guān)基因，得到支氣管擴(kuò)張癥-清肺化痰湯疾病共同基因

為獲取支氣管擴(kuò)張癥有關(guān)的基因，利用OMIM（https：//www.omim.org）、GeneCards（https：//www.genecards.org）兩個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Bronchiectasis syndrome”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，疾病-藥物共同基因需要取兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的交集，刪除清肺化痰湯重復(fù)靶基因，韋恩圖利用疾病與藥物靶基因在Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ve）在線平臺(tái)上繪制。

4 制作PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，藥物-疾病核心基因需要將藥物疾病交集基因?qū)隒ytoscape3.

7.2軟件上進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊螳@取STRING（https：//string-db.org/）網(wǎng)絡(luò)在線平臺(tái)可獲取藥物-疾病交集基因，即將藥物靶基因和疾病靶基因?qū)У皆撈脚_(tái)，選擇最低相互作用的閾值“Medium Confidence”為 0.4，蛋白屬種為“Homo Sapiens”，其他參數(shù)不變，將下載的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，利用CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，選擇中度中心性DC、局部邊連通性LAC、接近中心性CC和特征向量中心性EC數(shù)值中位值，介度中心性BC值2倍的中位值進(jìn)行設(shè)置，最后獲得相應(yīng)的核心基因。

5 核心基因的GO功能注射以及KEGG通路分析在微生信網(wǎng)站平臺(tái)上進(jìn)行

利 用 微生 信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）網(wǎng)站平臺(tái)，將清肺化痰湯-支氣管擴(kuò)張癥核心基因?qū)氲骄W(wǎng)站平臺(tái)中，對(duì)生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）分別進(jìn)行注釋，設(shè)置P-value值＜0.05，并且基因富集個(gè)數(shù)BP大于個(gè)，CC大于3個(gè)，MF大于3個(gè)，得到最終502個(gè)生物過(guò)程，分別選取3個(gè)生物過(guò)程中的前10個(gè)，繪制柱狀圖。設(shè)置P-value值＜0.05，基因富集數(shù)大于4個(gè)，進(jìn)行KEGG富集通路的分析，最終獲得99條通路。根據(jù)結(jié)果選取前40個(gè)KEGG通路制作富集氣泡圖。

研究結(jié)果

1 篩選清肺化痰湯活性成分

通過(guò)TCMSP平臺(tái)搜索清肺化痰湯各個(gè)藥物，查閱文獻(xiàn)，去除無(wú)相關(guān)靶點(diǎn)信息的活性成分，獲得活性成分247個(gè)，根據(jù)MOID搜索獲得靶基因共274個(gè)。有效成分統(tǒng)計(jì)半夏13個(gè)，茯苓15個(gè)，栝樓11個(gè)，黃芩36 個(gè)，苦杏仁18個(gè)，桑白皮32個(gè)，魚腥草7個(gè)，浙貝母7個(gè)，紫蘇子16個(gè)，甘草92個(gè)?？芍宸位禍ㄟ^(guò)多靶點(diǎn)、多成分發(fā)揮其作用。

2 構(gòu)建清肺化痰湯有效成分和靶蛋白基因的網(wǎng)絡(luò)圖

將藥物有效成分和靶蛋白基因制作屬性文件，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，設(shè)置參數(shù)值獲得相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1（四邊形代表清肺化痰湯藥物，菱形四邊形代表預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，菱形六邊形代表化合物，A1、B1、C1代表清肺化痰湯中藥物共有成分），根據(jù)網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置degree值大小，該值與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)之間的關(guān)系呈正相關(guān)，值越大關(guān)系越密切。最后根據(jù)Degree的值（50～153）選取清肺化痰湯關(guān)鍵成分，見表1。

表1 清肺化痰湯關(guān)鍵成分信息

圖1 清肺化痰湯藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

3 支氣管擴(kuò)張癥疾病基因靶點(diǎn)分析，獲取藥物與疾病共同基因

支氣管擴(kuò)張癥疾病基因通過(guò)OMIM、GeneCards兩個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，將所獲得的疾病基因全部導(dǎo)入表格，通過(guò)刪除重復(fù)值功能最終得到1289個(gè)疾病基因，清肺化痰湯藥物與支氣管擴(kuò)張癥交集基因利用Venny2.1網(wǎng)絡(luò)在線平臺(tái)獲取，共獲得共同基因77個(gè)。如圖2所示。

圖2 清肺化痰湯藥物與支氣管擴(kuò)張癥共同靶基因

4 藥物與疾病蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果分析，獲取藥物-疾病核心基因

藥物與疾病蛋白網(wǎng)絡(luò)在STRING網(wǎng)絡(luò)在線平臺(tái)上獲取，如圖3所示。將得到的TSV軟件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，核心基因藥物-疾病核心基因通過(guò)CytoNCA網(wǎng)絡(luò)插件獲得，設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)值，得到JUN（AP-1 轉(zhuǎn)錄因子亞單位）、MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）、AKT1（AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶 1）、IL6（白細(xì)胞介素6受體）、CXCL8（白細(xì)胞介素8受體）IL10（白細(xì)胞介素10受體）、TNF（腫瘤壞死因子）、TP53（腫瘤蛋白 P53）等核心基因，可知清肺化痰湯通過(guò)上述核心基因發(fā)揮其作用。

圖3 藥物與疾病共同基因PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

5 GO 功能注釋結(jié)果分析

清肺化痰湯-支氣管擴(kuò)張癥核心基因?qū)胛⑸旁诰€網(wǎng)站平臺(tái)，分別進(jìn)行分子功能、生物過(guò)程、細(xì)胞組分GO功能注釋，設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，得到502個(gè)生物過(guò)程。涉及細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、細(xì)胞因子、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物過(guò)程，如圖4，見表2。

表2 GO功能注釋和KEGG通路富集分析結(jié)果

圖4 GO 功能注釋分析

6 KEGG 通路富集結(jié)果分析

根據(jù)KEGG通路富集結(jié)果分析得出清肺化痰湯-支氣管擴(kuò)張癥主要富集在toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、白介素-17信號(hào)通路、以及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAG信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等通路。其中TNF信號(hào)通路參與的基因有AKT1，IL1B，IL6，JUN，MMP9，MAPK3，PTGS2，CCL2，CASP3，TNF。toll樣受體信號(hào)通路有 AKT1，IL1B，IL6，CXCL8，JUN，MAPK3，TNF基因參與等。如圖5所示，見表2。

圖5 KEGG 通路富集分析

討 論

1 支氣管擴(kuò)張癥相關(guān)發(fā)病機(jī)制

惡性循環(huán)假說(shuō)論述了支氣管擴(kuò)張癥發(fā)病過(guò)程，強(qiáng)調(diào)了感染、炎癥和酶作用三個(gè)重要環(huán)節(jié)[7]。氣道炎癥是支氣管擴(kuò)張癥發(fā)生和發(fā)展的核心。相關(guān)研究表明，中性粒細(xì)胞炎癥作為支氣管擴(kuò)張癥患者氣道炎癥的重要環(huán)節(jié)，主要通過(guò)生成趨化因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)蛋白酶和微生物肽的釋放，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[8-9]。而對(duì)于氣道炎癥，西醫(yī)多采用抗生素抗感染治療，但長(zhǎng)期盲目使用抗生素控制感染容易出現(xiàn)細(xì)菌多重耐藥情況，以及藥物不良反應(yīng)的發(fā)生[10]。因此有關(guān)酶作用和氣道炎癥的研究對(duì)研發(fā)新藥物治療支氣管擴(kuò)張癥有顯著意義。

2 清肺化痰湯活性成分的作用機(jī)制

在藥物-成分-靶蛋白基因網(wǎng)絡(luò)中分析得出山萘酚、芒柄花黃素、槲皮素、豆甾醇、桑辛素F、以及黃芩素、β-谷固醇等關(guān)鍵成分。研究表明不僅促炎酶活性，受山奈酚的調(diào)控，還有相關(guān)炎癥基因的表達(dá)也受到山奈酚的調(diào)控，其發(fā)揮抗炎作用主要與抑制轉(zhuǎn)錄因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等有關(guān)[11]。山奈酚可以降低白細(xì)胞介素-8 和干擾素誘導(dǎo)蛋白-10、等炎癥因子釋放，來(lái)發(fā)揮抗炎作用，過(guò)程與PI3K、MAPK和Janus 激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄激活通路相關(guān)[12]。研究表明豆甾醇起到抗炎作用，與抑制環(huán)氧化酶-2的表達(dá)，促進(jìn)一氧化氮合酶的表達(dá)密切相關(guān)[13]。有研究證明黃芩素具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、保護(hù)肝臟、神經(jīng)元和心腦血管等生物學(xué)的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素有抗炎、抗病毒作用[15]。由此可知上述清肺化痰湯關(guān)鍵成分在治療支氣管擴(kuò)張癥中發(fā)揮重要的抗炎作用。

3 清肺化痰湯治療支擴(kuò)的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

由PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，得出清肺化痰湯與支氣管擴(kuò)張癥共同基因，然后通過(guò)CytoNCA進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，最終獲得清肺化痰湯作用于支氣管擴(kuò)張癥的核心基因可能為JUN（AP-1 轉(zhuǎn)錄因子亞單位）、AKT1（AKT 絲氨酸 /蘇氨酸激酶 1）、MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）、IL6（白細(xì)胞介素6受體）、IL10（白細(xì)胞介素10受體）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）、MAPK3（絲裂原活化蛋白激酶3）、TNF（腫瘤壞死因子）等。相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)支氣管擴(kuò)張癥中基質(zhì)金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶好及半胱氨酸蛋白酶失衡，會(huì)出現(xiàn)一定的肺功能障礙等[16-18]。絲氨酸蛋白酶可以通過(guò)蛋白水解來(lái)激活生長(zhǎng)因子，不僅可以切割粘附分子，還有助于淋巴細(xì)胞的活化[19]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-8活性受MMP-9激活調(diào)控[20]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-6能夠引起炎癥反應(yīng)，作用機(jī)理是加速B細(xì)胞增生分化，生成抗體[21]。CXCL8和TP53與腫瘤、癌癥相關(guān)，可以影響細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、侵襲和遷移[22-23]，通過(guò)抑制TP53減輕上皮細(xì)胞的凋亡和肺部炎癥[24]。

4 清肺化痰湯作用的生物過(guò)程和信號(hào)通路

通過(guò)GO功能注釋分析結(jié)果獲得核心基因主要富集于細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物過(guò)程是對(duì)核心基因進(jìn)行GO功能注釋的結(jié)果。多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程涉及了 AKT1、IL6、CXCL8、IL10、VEGFA、MAPK3、PTGS2、TNF、TP53等核心靶點(diǎn)。蛋白酶作為支氣管擴(kuò)張癥多種作用機(jī)制中的分子，在調(diào)節(jié)炎癥、對(duì)抗感染以及參與肺組織重塑中發(fā)揮著重要作用[25]。通過(guò) KEGG 通路結(jié)果分析，清肺化痰湯-支氣管擴(kuò)張癥核心基因主要富集在腫瘤壞死因子通路、IL-17信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、toll樣受體信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路中。有研究表明可以通過(guò)抑制 MAPK 信號(hào)，從而抑制炎性反應(yīng)，抑制細(xì)胞的凋亡[26]。toll樣受體信號(hào)通路需要Toll-IL 1受體（TIR）含結(jié)構(gòu)域的適配器蛋白（TIRAP），蛋白激酶以及轉(zhuǎn)錄因子來(lái)傳遞信號(hào)，通過(guò)激活MAPK（絲裂原激活的蛋白激酶）和NF-κB來(lái)抑制炎癥反應(yīng)。研究已證明p38 MAPK信號(hào)通路可以通過(guò)腫瘤侵襲、炎癥反應(yīng)等途徑發(fā)揮在肺部疾病中的重要作用[27]。有研究發(fā)現(xiàn)抑制 p38 MAPK活化可以緩解平滑肌細(xì)胞增生從而改善氣道的重塑[28]。

根據(jù)以上結(jié)果分析，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究得出清肺化痰湯中多種藥物含有β-谷固醇、桑辛素F、山萘酚、槲皮素、豆甾醇等成分，參與調(diào)控細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、細(xì)胞因子、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物過(guò)程，主要核心基因有 MMP-9、TP53、IL10、MAPK1等，TNF信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TLR信號(hào)通路是主要通路，還涉及的通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAG信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路，干預(yù)炎癥反應(yīng)和酶的作用及細(xì)胞因子活性等過(guò)程，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)和減輕氣管損傷和氣道重塑的作用，其結(jié)果為臨床應(yīng)用及后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化等提供了重要的理論依據(jù)。