黃貴發(fā)，王瑜婷，鐘 霞，余欣彤，徐東婷，邱彩月，陳江平

廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244

茅莓根為薔薇科懸鉤子屬植物茅莓Rubus parvifolliusL.的干燥根，又名紅梅消、大暑莓、蛇泡簕、烏泡根，為民間常用中草藥，資源豐富，主產(chǎn)于廣東、山東、河南、廣西等地，具有清熱解毒、祛風利濕、活血涼血的功效，用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、風濕痹痛、濕熱黃疸、熱毒瀉痢等癥［1-5］。茅莓根收載于1977 年版《中華人民共和國藥典》一部，之后各版均未記載，茅莓根為2020 年版《中華人民共和國藥典》一部成方制劑鼻咽靈片和鼻咽清毒顆粒的主要組成之一［6］?，F(xiàn)代研究表明，茅莓根的化學成分主要有黃酮、二萜、三萜及三萜皂苷類成分，其中黃酮類成分表兒茶素具有保肝、抗癌、抗氧化的藥理作用［7-10］。目前，國內(nèi)外對茅莓根的研究較少，主要集中在藥材化學成分和質(zhì)量控制方面，鮮見茅莓根制劑相關(guān)研究報道［11-12］。本研究以水為提取溶劑，采用煎煮法提取，以浸泡時間、加水量、煎煮次數(shù)和煎煮時間4個因素設計L9（34）正交試驗，以干膏得率和表兒茶素含量為質(zhì)量評價指標，權(quán)重系數(shù)分別設為0.7、0.3進行綜合評價，篩選出最佳水提工藝，為茅莓根相關(guān)制劑的進一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器Waters Arc 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Milli-Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國Merck公司）；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TC-15 型套式恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；YRE-501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵、DLSB-5L/20 型低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DHG-9146A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏試驗設備有限公司）。

1.2 試劑與試藥表兒茶素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110878-200102）；甲醇（德國Merck 公司，色譜純）；N，N-二甲基甲酰胺（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純）；水為超純水，其他試劑為分析純；茅莓根藥材（批號：Y200601）產(chǎn)地為廣東，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，符合《廣東省中藥材標準（第三冊）》茅莓根項下相關(guān)要求［1］。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提液制備取茅莓根飲片適量，分成9份，每份約100 g，按正交試驗設計進行回流提取，濾過，分別合并每組試驗的水提液，減壓濃縮，定容至50 mL，得樣品濃縮液。

2.2 干膏得率測定精密吸取茅莓根水提液25 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，干膏得率計算公式：

2.3 表兒茶素含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為YMC Triart C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為：（0.04 mol/L枸櫞酸溶液-N，N-二甲基甲酰胺=45∶8）-甲醇=98∶2；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 取表兒茶素對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇制成每1 mL含表兒茶素0.05 mg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 精密吸取樣品濃縮液2 mL 至50 mL 量瓶中，加入50%甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇定容至50 mL，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及空白溶劑適量，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。表兒茶素對照品溶液在33 min左右出峰，供試品溶液在相應時間有峰與之對應，而空白溶劑在33 min 左右無峰，表明其對表兒茶素的測定無干擾，該方法專屬性良好。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取表兒茶素對照品7.522 mg，加50%甲醇定容至25 mL，制成濃度為300.88 μg/mL的表兒茶素對照品母液，分別取0.5、1、2、5、8、10 mL對照品母液置10 mL量瓶中，用50%甲醇定容到刻度，得一系列對照品溶液，濃度 分 別 為15.044、30.088、60.176、150.440、240.704、300.88 μg/mL，按上述色譜條件進樣測定，以對照品溶液濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得表兒茶素回歸方程為Y=8972.9095X-12390.3725（r2=0.9998），說明表兒茶素在15.044～300.88 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度考察 取“2.3.5”項下濃度為60.176 μg/mL 的對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，計算表兒茶素峰面積的RSD為0.37%，說明儀器精密度良好。

2.3.7 重復性考察 取同一樣品濃縮液，按“2.3.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，計算表兒茶素峰面積的RSD為0.76%，說明該方法重復性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，于制備0、2、4、8、12、24 h 后按上述色譜條件進樣測定，計算表兒茶素峰面積的RSD為0.79%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 加樣回收試驗 取已知含量的樣品濃縮液適量，精密吸取9 份，每份1.0 mL，置于50 mL量瓶中，分為3 組，分別按高、中、低濃度精密加入表兒茶素對照品溶液適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，計算平均加樣回收率為101.7%，RSD 為2.57%，說明該方法準確度良好，見表1。

表1 表兒茶素加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.4 水提工藝優(yōu)化

2.4.1 正交試驗 采用L9（34）正交試驗優(yōu)選茅莓根水提工藝。以干膏得率和表兒茶素含量為質(zhì)量評價指標，結(jié)合前期單因素考察的試驗結(jié)果，選取浸泡時間（A）、加水量（B）、煎煮時間（C）和煎煮次數(shù)（D）為考察對象，因素水平設計見表2。

表2 因素水平設計

2.4.2 數(shù)據(jù)處理 多指標試驗綜合加權(quán)評分法是將試驗結(jié)果進行歸一化處理后，根據(jù)各項評價指標在整個試驗中的重要性，設定不同權(quán)重進行評分的一種方法，在保證分析指標較為全面的同時，對于關(guān)鍵影響因素又給予了相應側(cè)重，使結(jié)果分析更加全面、科學、合理［13-16］。本研究將各項指標的結(jié)果通過歸一化處理后，設定干膏得率和表兒茶素含量的權(quán)重系數(shù)分別為0.7、0.3，得到綜合評分，歸一化值=（指標值-指標最小值）/（指標最大值-指標最小值）［17-19］；綜合評分=干膏得率歸一化值×70%+表兒茶素歸一化值×30%。見表3—4。

表3 茅莓根水提工藝正交直觀分析

表4 茅莓根水提工藝正交方差分析

由直觀分析得出，影響因素D＞C＞B＞A，即煎煮次數(shù)＞煎煮時間＞加水量＞浸泡時間，其中，A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D2＞D1，最優(yōu)組合為A2B3C2D3；方差分析表明煎煮次數(shù)（D）對試驗結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），浸泡時間（A）、加水量（B）、煎煮時間（C）3 個因素對試驗結(jié)果無顯著影響（P＞0.05），在實際生產(chǎn)中，從節(jié)約自然資源、提高生產(chǎn)效率等方面考慮，確定最佳水提工藝為A1B2C1D3，即加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮3次，每次0.5 h。

2.4.3 驗證試驗 稱取茅莓根飲片3 份，每份約100 g，按優(yōu)選的水提工藝進行回流提取，結(jié)果表明，驗證試驗各指標的RSD均小于2%，說明優(yōu)選的茅莓根水提工藝穩(wěn)定可行。見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果（n=3）

3 討論

本研究在表兒茶素HPLC 含量測定方法的建立過程中，對不同廠家和型號的色譜柱（Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBRIDGE C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和YMC Triart C18（150 mm×4.6 mm，5 μm））進行考察，分別比較了各色譜柱的出峰時間、峰型、分離度以及適用性，最終確定YMC Triart C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）為本研究方法的色譜柱；在進行流動相比例的選擇時，曾采用甲醇-0.01 mol/L 枸櫞酸（20∶80）進行測定［20］，分離效果差，后參考兒茶中表兒茶素含量測定方法［6］，加入一定比例N，N-二甲基甲酰胺，采用甲醇-（0.04 mol/L 枸櫞酸-N，N-二甲基甲酰胺=45∶8）比例分別為（5∶95）（3∶97）（2∶98）等進行測定，最后選定（2∶98）比例，在此條件下表兒茶素的分離效果和出峰時間均較好。

本研究以干膏得率結(jié)合表兒茶素含量，并采用綜合評分法結(jié)合正交設計優(yōu)選出茅莓根的水提工藝。文獻表明，茅莓根中還含有大量三萜及皂苷類成分［7］，僅以表兒茶素含量作為優(yōu)選水提工藝的質(zhì)量指標略有不足，因此，在后續(xù)研究中，可將表兒茶素含量結(jié)合三萜及皂苷類成分含量作為質(zhì)量指標進行綜合評價，從而更客觀反映水提工藝的優(yōu)劣，為茅莓根的相關(guān)制劑研究提供依據(jù)。