梁五林，崔 爽，張明倩，祝 娜，張碩峰，3，賈占紅△

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488； 2 中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081；3 西藏藏醫(yī)藥大學(xué)藏藥系，西藏 拉薩 850030

目前，心血管疾病仍是全球范圍內(nèi)引起人們死亡和發(fā)病的主要原因，而缺血性心臟病與心血管疾病死亡率緊密相關(guān)，約占整個心血管疾病死亡的50%［1］。急性心肌梗死是心肌缺血（myocardial ischemia，MI）中較為嚴(yán)重的心血管疾病，梗死心肌恢復(fù)血流再灌之后進(jìn)一步加重心肌損傷，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象被稱為缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）［2］。IRI 涉及的病理因素包括氧化損傷、能量代謝障礙、Ca2+超載、線粒體損傷、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等［3-5］。MI及IRI是影響心血管疾病發(fā)病率、致死率、傷殘率升高的最主要因素。

紅花黃色素注射液（safflower yellow injection，SYI）是以紅花為基礎(chǔ)研制而成的中藥注射劑，主要成分為羥基紅花黃色素A（HSYA），經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療心絞痛等心臟病。HSYA 是紅花的主要生物活性成分，是一種具有良好藥用價值的天然色素，在干花中的含量為0.235%～2.074%，也 是 紅 花 的 質(zhì) 量 標(biāo) 志 物［6］。HSYA 因其廣泛的藥理活性而受到關(guān)注，現(xiàn)代藥理研究表明，HSYA 具有改善心腦血管疾病、緩解肝臟缺血損傷、肺急性損傷、抑制肺纖維化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)代謝和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等多種生物學(xué)作用［4］。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法分析HSYA治療MI的靶點和通路，為SYI治療MI的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。見圖1。

圖1 HSYA化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 數(shù)據(jù)庫與軟件

PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Targetnet數(shù)據(jù)庫（http：//targetnet.scbdd.com/）、CTD數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/）、UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）、STITCH數(shù)據(jù)庫（http：//stitch.embl.de/）、ChEMBL數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/chembl/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù) 庫（https：//omim.org）、STRING11.0 數(shù) 據(jù) 庫（https：//string-db.org）、DAVID 6.8 數(shù) 據(jù) 庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）、RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）、Venn 圖在線繪制工具Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）、在線作圖平臺Sanger Box（http：//sangerbox.com/Tool/）；分 析 軟 件Cytoscape 3.7.2、分子對接軟件包括PyRx、Auto DockTools-1.5.6、Open Babel GUI 及分子對接作圖軟件PyMol。

2 方法

2.1 HSYA 相關(guān)靶點的獲取和篩選分別從Targetnet、CTD、STITCH、ChEMBL 等數(shù)據(jù)庫中獲取HSYA 相關(guān)靶點，使用UniProt 數(shù)據(jù)庫將所得靶點進(jìn)行校正，最終得HSYA活性成分的基因靶點。

2.2 Ml相關(guān)靶點獲取以“Myocardial ischemia”為檢索詞，分別在人類基因數(shù)據(jù)庫（the human gene database,GeneCards）和在線孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）獲取MI 相關(guān)靶點，將所得靶點匯總并去除重復(fù)靶點。

2.3 獲取HSYA與Ml共同靶點利用Venny 2.1在線分析工具對HSYA與MI相關(guān)靶點進(jìn)行對比分析，以Venn圖的形式展現(xiàn)HSYA與MI的交集靶點。

2.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)路（protein-protein interaction，PPl）將HSYA-MI交集靶點導(dǎo)入STRING 11.0在線數(shù)據(jù)庫，將研究物種設(shè)置為“Homosapiens”，Minimum required interaction score 為mediumconfidence＞0.400，隱藏孤立的靶點蛋白，從而得到靶標(biāo)之間的相互關(guān)系，保存為TSV 格式。再將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI，節(jié)點大小和顏色深淺反映degree值大小，degree 值越大，節(jié)點越大，顏色越深。

2.5 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG 富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）將HSYA-MI 交集靶點導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“Homosapiens”，將靶基因名修正為官方名稱（official gene symbol），設(shè)定閾值P＜0.05，進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，將P值由小到大排序前20位的富集結(jié)果導(dǎo)入SangerBox在線作圖平臺進(jìn)行可視化展示。

2.6 成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出KEGG 通路富集分析中P值由小到大排序前20 位的通路，通過查閱文獻(xiàn)，再篩選出可能與治療MI 有關(guān)的通路，找出富集在這些通路上的HSYA治療MI的潛在靶標(biāo)，將成分、靶標(biāo)、通路輸入Cytoscape 3.6.2軟件，繪制出成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2.7 分子對接從RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫中獲取“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值較高的靶點和PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因的3D 結(jié)構(gòu)PDB 格式文件，運用PyMOL 軟件移除靶蛋白中的水和配體；在PubChem中下載HSYA結(jié)構(gòu)文件，并使用Open Babel GUL軟件轉(zhuǎn)換為mol2格式文件；使用PyRx軟件對HSYA進(jìn)行能量最小化處理，使用AutoDock Tools 1.5.6對蛋白分子進(jìn)行加氫、計算電荷、設(shè)置原子類型等操作，并將蛋白和HSYA保存為pbdqt格式文件；在RyRx 中調(diào)用AutoDock Vina 算法進(jìn)行模擬對接；使用PyMOL軟件進(jìn)行可視化分析。

3 結(jié)果

3.1 HSYA 相關(guān)靶點從Targetnet 中獲得靶點54 個，從ChEMBL 中獲得靶點25 個，從CTD 中獲得靶點10個，從STITCH中獲得靶點1個，結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫確認(rèn)及轉(zhuǎn)換，無重復(fù)靶點，共得到90 個HSYA相關(guān)靶點，見表1。

表1 HSYA潛在靶標(biāo)信息

3.2 Ml 靶點獲取從GeneCards 中獲得MI 靶點2395 個，從OMIM 中獲得MI 靶點556 個，去除重復(fù)靶點364個，最終獲得MI靶點2587個。

3.3 HSYA 與Ml 共 同 靶 點HSYA 與MI 靶 點 融 合后獲得54 個交集靶點，見表2，結(jié)果以Venn 圖形式展示，見圖2。

表2 HSYA與Ml交集靶點

圖2 HSYA與MI交集靶點韋恩圖

3.4 PPl 網(wǎng)絡(luò)PPI 網(wǎng)絡(luò)中包含節(jié)點51 個，邊線244 條，根據(jù)Degree 大小排序，其中排名前10 的靶標(biāo)為白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、熱休克蛋白90α家族A 類成員1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、半胱天冬氨酸蛋白酶8（caspase 8，CASP8）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、過氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，NOS2）、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM1），它們與HSYA治療MI關(guān)系最密切，見圖3及表3。

表3 HSYA潛在靶點拓?fù)浞治鲋?/p>

圖3 HSYA潛在靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)

3.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

3.5.1 GO功能富集 將54個HSYA-MI交集基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫，通過GO功能富集分析得到GO條目392 個（P＜0.05），其中323 個生物過程（biological process，BP）條目，23 個細(xì)胞組成（cellular component，cc）條目，46 個分子功能（molecular function，MF）條目，分別選取P值排名前20 位作可視化展示。其中生物過程主要包括：氮化合物代謝過程的正調(diào)控、DNA 模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，對有機物質(zhì)、炎性、創(chuàng)傷的反應(yīng)，細(xì)胞活化、增殖、凋亡調(diào)節(jié)，細(xì)胞因子調(diào)控及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等；細(xì)胞成分包括：質(zhì)膜、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜小葉等；分子功能包括：相同的蛋白結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、啟動子結(jié)合、蛋白激酶C 活性、類固醇激素受體活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、鈣通道活性、鈣依賴性蛋白激酶C 活性、蛋白質(zhì)均二聚化活性等。見圖4。

圖4 HSYA-MI交集基因GO功能富集結(jié)果

3.5.2 KEGG通路富集 共得到通路17條（P＜0.05），剔除與MI 關(guān)系不大的通路，共獲得10 條通路，涉及癌癥、免疫、炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮功能、凋亡等，分別是腫瘤信號通路、NOD 樣受體信號通路、Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）信號通路、FcεRI 信號通路、病毒性心肌炎、FcγR 介導(dǎo)的吞噬作用、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、緊密連接及細(xì)胞凋亡，見圖5及附圖1—2。

圖5 HSYA-MI交集基因KEGG通路富集結(jié)果

附圖1 腫瘤信號通路

附圖2 凋亡信號通路

3.6 成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)合GO和KEGG富集分析結(jié)果，篩選出可能具有MI 作用的通路，并與HSYA的潛在靶標(biāo)一一對應(yīng)，構(gòu)建HSYA-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中包含39個節(jié)點，98條邊線。對該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，靶點的平均度值為3.1，介值中心度均值為0.0147；信號通路的平均度值為5.8，介值中心度均值為0.0207。篩選出度值及介值中心度均大于均值的靶點9 個、信號通路2 條，它們在HSYA 治療MI 中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。見圖6及表4。

表4 網(wǎng)絡(luò)圖拓?fù)浞治?/p>

圖6 HSYA-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)

4 分子對接結(jié)果

結(jié)合能小于0 說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，且結(jié)合能量越低，配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能≤-5.0kcal/mol 說明分子與靶點對接較好。將HSYA 與“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值較高的靶點FYN、PRKCB、Akt2、PRKCG、XIAP 與PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前10 的靶點IL-6、TNF、HSP90AA1、APP、MMP9、CASP8、ESR1、PPARG、NOS2、ICAM1 進(jìn)行分子對接，并對蛋白靶點的原配體進(jìn)行分析，得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖分析（對接結(jié)果只保留每對分子對接的結(jié)合能絕對值最高的）。其中HSYA 與靶點IL-6、TNF、APP、MMP9、CASP8、ESR1、PPARG、ICAM1、PRKCB的結(jié)合能絕對值均大于原配體結(jié)合能的絕對值，且HSYA與各靶點的結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，表明HSYA 與有效靶點具有較好的結(jié)合活性。將以上對接結(jié)果利用PyMOL 軟件繪圖，可得到HSYA與各靶點形成氫鍵的氨基酸殘基和位置信息，見表5及圖7—8。

表5 HSYA與各靶點形成氫鍵的氨基酸殘基和位置信息

圖7 分子對接數(shù)據(jù)熱圖分析（kcal/mol）

圖8 分子對接模式

5 討論

MI 是心臟所需血氧、能量失衡而導(dǎo)致的一種病理狀態(tài)，冠狀動脈粥樣硬化是引起MI 的常見病因［5-6］。MI損傷的病理基礎(chǔ)較為復(fù)雜，涉及多種基因、蛋白、致病因素等共同作用［7-8］。故本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法對SYI 主要成分、靶點、疾病的生物信息構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而探討SYI 治療MI的整體機制。

在PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中，IL-6、TNF、HSP90AA1、APP、MMP9、CASP8、ESR1、PPARG、NOS2、ICAM1 等為核心靶點。TNF-α與IL-6 為常見的促炎因子，在心肌梗死模型中，TNF-α與IL-6釋放增加，誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)［9］。MI 可引起內(nèi)皮功能障礙，表現(xiàn)為NO 產(chǎn)生受損，而NO 具有舒張血管、抑制炎癥反應(yīng)和血栓形成的作用［10-11］。MMP9 屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)家族，參與細(xì)胞外基質(zhì)的分解，有研究表明抑制MMPs 表達(dá)可減弱與慢性充血、高血壓、心肌梗死等疾病相關(guān)的心肌重塑［12］。此外，TNF-α 可通過增強包括MMP9 在內(nèi)的MMPs 活性減少膠原蛋白合成，調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞外基質(zhì)代謝［13］。故推測HSYA 也可通過抑制TNF-α表達(dá)降低MMP9 的活性，從而減輕MI 引起的心臟重塑。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）又稱應(yīng)激蛋白，當(dāng)機體處于高溫、氧化應(yīng)激、感染、缺血等狀態(tài)時可被誘導(dǎo)表達(dá)，從而保護(hù)機體，有保護(hù)組織缺血再灌注免受損傷的作用［14］。HSP90AA1 為HSP90α家族A 類1 型,有研究表明，miR-1可負(fù)調(diào)控HSP90AA1，MI期間抑制miR-1和恢復(fù)HSP90AA1 的表達(dá)可減輕MI 損傷［15］。APP 為淀粉樣前體蛋白，在MI 模型大鼠中，可溶性APP770（sAPP770）從內(nèi)皮細(xì)胞和血小板中釋放出來，且血漿sAPP 的增加先于心肌酶的釋放，表明sAPP770可作為心肌梗死早期生物標(biāo)志物的可能性［16］。PPARG 為核受體超家族成員，在動脈粥樣硬化病變中，PPARG 高度表達(dá)，其激活可改善心血管細(xì)胞的炎癥作用；PPARG還可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中NOS的表達(dá)，從而增加NO 生物利用度［17-18］。半胱天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族為細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，而CASP8 是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑（外源性途徑）中的關(guān)鍵啟動子。已有研究表明紅花甲醇提取物可減少由LPS誘導(dǎo)的Caspase-8、BID 和t-BID等死亡受體蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡［19］。故推測其中發(fā)揮抗凋亡的主要活性成分為HSYA，對MI發(fā)生時細(xì)胞的外源性凋亡途徑有抑制作用。ESR1為雌激素受體1，通過編碼核受體雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)與雌激素17-β-雌二醇相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能。在MI 和MI 再灌注動物模型中，ERα激活可減少梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)血管舒張并增加新血管形成［20］。另外也有研究證實HSYA 可促進(jìn)雌激素受體陽性細(xì)胞T47D 中ERα的表 達(dá)［21］。故 推 測 在MI 時，HSYA 可 作 用 于 心 臟ERS1，激活ERα發(fā)揮保護(hù)作用。通過以上核心靶標(biāo)分析可知，HSYA 可能通過抑制炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、心臟重塑、氧化應(yīng)激，舒張血管，改善血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)血管生成等多條途徑治療MI，改善MI損傷。

在KEGG 通路富集中，有10 條通路與HSYA 治療MI 顯著相關(guān)，且在“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中，由拓?fù)浞治隹芍[瘤信號通路和凋亡通路相關(guān)度最高。其中腫瘤信號通路富集基因數(shù)量最多，包括多條下游信號通路，如Wnt信號通路、mTOR信號通路、PI3/Akt 信號通路、JAK/STAT 信號通路、MAPK信號通路、HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路、Notch信號通路、p53 信號通路、TGF-β信號通路、鈣信號通路等。HIF-1 是一種調(diào)節(jié)氧濃度穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α可激活VEGF 信號通路促進(jìn)血管生成，還可激活NOS2 轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)血管舒張［22］。TGF-β信號通路參與細(xì)胞和組織的生長、發(fā)育、分化。已有研究證明紅花乙醇提取物可抑制TGF-β1/MMP9 以減輕高血壓模型大鼠的心臟重塑［23］。Smads 為TGF-β重要的信號傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子，丹參酸可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad 信號通路抑制心肌纖維化［24］。故推測紅花抗纖維化的作用可能與其主要成分HSYA 作用于TGF-β1/Smad 信號通路，抑制MMP9 表達(dá)有關(guān)。鈣信號通路可調(diào)控動脈粥樣硬化易感性及其炎癥反應(yīng)，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［25］。p53 信號通路部分介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡在心肌梗死后的病理重塑和心力衰竭的進(jìn)展中起至關(guān)重要作用，抑制p53水平可減少心肌細(xì)胞凋亡［26］。另外在凋亡通路中，HSYA 還可能通過作用于TNF、CASP8、XIAP、MAP3K5(ASK1)、AKT、PAPR 等靶點抑制細(xì)胞內(nèi)源性、外源性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡。此外，Wnt信號通路、Notch 信號通路、MAPK 信號通路、PI3/Akt/mTOR、JAK/STAT 信號通路等也參與MI 再灌注損傷，起到保護(hù)性或促損傷性作用［27］。病毒性心肌炎的下游信號通路為T 細(xì)胞受體信號通路。T細(xì)胞受體（TCR）信號通路參與T 細(xì)胞激活，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)。缺血后組織中CD4+T 細(xì)胞明顯積聚，提示這些免疫細(xì)胞可能參與了I/R損傷的發(fā)病機制［28］。固有免疫的主要信號通路為NOD 樣受體與TLR 信號通路。NOD 蛋白與下游的受體相互作用磷酸化，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，介導(dǎo)炎癥介質(zhì)表達(dá)［29］。TLR 能識別內(nèi)源性與外源性“危險分子”，啟動炎性免疫應(yīng)答，TLR4在MI中對誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)并激活下游信號(如NF-κB)起重要作用［30］?？梢?，SYI可通過多靶點、多通路治療MI。

綜上所訴，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù),初步探討了SYI 治療MI 的作用機制。同時基于分子對接技術(shù)初步模擬其可能的分子作用機制，或可為SYI 的后續(xù)研究提供新的思路與方法。但是本研究僅從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的角度對SYI 治療MI 的分子機制進(jìn)行了探討，具有一定局限性,還需要進(jìn)一步的研究驗證。