楊凡芮，韓建文

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

銀屑病是一種多因素誘發(fā)的免疫性疾病。特征性皮損是境界清楚、上附銀白色鱗屑的紅色斑塊，局限或廣泛分布。中國(guó)患病率為 0.47%，且呈現(xiàn)逐年增高趨勢(shì)［1］。銀屑病的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，包含免疫、遺傳、環(huán)境等多種因素。目前已有越來(lái)越多的研究表明抗原呈遞所引起的免疫因素在其發(fā)病過(guò)程中尤為重要，遺傳學(xué)及免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：參與抗原呈遞的一些相關(guān)基因（如HLA-C、ERAP1、CD1a）與銀屑病的發(fā)病機(jī)制具有密切的關(guān)系。本研究擬以尋常型銀屑?。╬soriasis vulgaris，PsV）和泛發(fā)性膿皰型銀屑?。╣eneralized pustular psoriasis，GPP）患者為對(duì)象，研究皮損中ERAP1、HLA-C、CD1a 的表達(dá)水平，與健康對(duì)照的皮膚組織進(jìn)行比較。探討3 種基因在2 種類型銀屑病中的表達(dá)及其在銀屑病中的致病作用。

1 資料和方法

1.1 病例資料 選擇2014 年至2019 年就診于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，經(jīng)組織病理確診的38例PsV 患者和21 例GPP 患者，所有患者取材前3 個(gè)月未經(jīng)任何治療，無(wú)系統(tǒng)性疾病、結(jié)締組織疾病及腫瘤；并選取33 名健康人皮膚組織為對(duì)照組，3 組間的性別及年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。所有實(shí)驗(yàn)標(biāo)本為石蠟包埋組織。本研究通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

表1 研究對(duì)象的性別、年齡基本特征［±S/n（%）］

表1 研究對(duì)象的性別、年齡基本特征［±S/n（%）］

1.2 試劑 標(biāo)準(zhǔn)化免疫組化試劑盒，包括一抗（兔抗人ERAP1、HLA-C、CD1a 抗體），二抗（山羊抗兔血清）、顯色劑等，購(gòu)自Solarbio 公司。石蠟、甲醛、二甲苯等試劑購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方法 所有標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林溶液固定48 小時(shí)，常規(guī)洗滌與脫水，石蠟包埋，（4～7）μm 厚切片，撈片于處理過(guò)的防脫片上，60 ℃烤干，4 ℃保存?zhèn)溆?。具體操作按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行，已知陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照均來(lái)自于我院皮膚科就診人群，PBS 代替一抗作空白對(duì)照。免疫組化使用 Envision二步法，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡觀察。通過(guò)顯微鏡拍照，采集樣本相關(guān)部位，蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB 顯出的陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色。

1.3.2 結(jié)果評(píng)定 免疫組化染色后的病理片利用Image-pro plus 6.0 軟 件（Media Cybernetics，Inc，Rockville，MD，USA）進(jìn)行圖像分析，選取相同的棕色作為判斷所有照片陽(yáng)性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出每張照片IOD 值代表平均蛋白表達(dá)強(qiáng)度。陽(yáng)性細(xì)胞比值=陽(yáng)性面積/照片總面積。每張切片選擇3 個(gè)視野取平均值作為最終統(tǒng)計(jì)用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，多組間的比較采用方差分析，不符合正態(tài)分布的資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，多組獨(dú)立樣本比較選用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，進(jìn)一步多組間兩兩比較選用兩個(gè)獨(dú)立樣本的Mann-Whitney U 檢 驗(yàn)（α ＜0.017）。HLA-C、ERAP1、CD1a 表達(dá)之間的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析，以檢驗(yàn)水準(zhǔn) P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HLA-C 在PsV 組、GPP 組、對(duì)照組中的陽(yáng)性細(xì)胞比值分別為0.09（0.06，0.13）、0.05（0.02，0.08）和0.07（0.04，0.10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較，PsV 與GPP 組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（表2）。3 組中的HLA-C 的平均蛋白表達(dá)強(qiáng)度IOD 值分別為157834.49（98023.56，215894.83）、86193.29（38543.91，142187.79）、111118.73（59200.77，141852.99），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。其中，PsV 與對(duì)照組、PsV 與GPP 組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（表3）。

表2 HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV、GPP 皮損中表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞比值［M（P25，P75）］

表3 HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV、GPP 皮損中熒光平均蛋白表達(dá)強(qiáng)度IOD 比較［M（P25，P75）］

ERAP1 在PsV 組、GPP 組、對(duì)照組中的陽(yáng)性細(xì)胞比值分別為 0.13（0.06，0.18）、0.10（0.06，0.13）、0.03（0.02，0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。兩兩比較，PsV 與對(duì)照組、GPP 與對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（表2）。ERAP1 的平均蛋白表達(dá)強(qiáng)度IOD 值分別為192091.46（77072.75，258680.10）、100684.51（87829.41，194942.43）、37534.33（21187.75，70946.6583），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。其中，PsV 與對(duì)照組、GPP 與對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（表3）。

CD1a 在PsV 組、GPP 組、對(duì)照組中的陽(yáng)性細(xì)胞比值分別為0.02（0.00，0.09）、0.01（0.00，0.03）、0.00（0.00，0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。兩兩比較中，PsV 與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（表2）。CD1a 的平均蛋白表達(dá)強(qiáng)度IOD 值分別為31494.78（4783.86，154509.35）、12090.99（6349.54，61491.74）、3714.05（1201.07，19573.10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。其中，PsV 與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.05）（表3）。

為分析這3 種基因在皮損中表達(dá)的相關(guān)性，在PsV組中利用Spearman 相關(guān)進(jìn)行分析。結(jié)果表示HLA-C 與CD1a 熒光IOD 值具有相關(guān)性（rs=0.370，P=0.022）（圖1a）；ERAP1與CD1a熒光IOD值具有相關(guān)性（rs=-0.383，P=0.018）（圖1b）；ERAP1 與HLA-C 熒光IOD 值無(wú)相關(guān)性（rs=-0.012，P=0.943）（圖1c）。

圖1 HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV 皮損中表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

銀屑病是一種以 T 細(xì)胞介導(dǎo)的角質(zhì)細(xì)胞增殖為特征的自身免疫性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。根據(jù)銀屑病的臨床特征，可分為尋常型、膿皰型、關(guān)節(jié)型和紅皮病型銀屑病，其中 PsV 占90%以上，GPP 較少見(jiàn)，可由PsV 發(fā)展而來(lái)并威脅人類生命健康［2］。

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物（Major histocompatibility complex，MHC）的表達(dá)產(chǎn)物，具有高度多態(tài)性，可以改變內(nèi)源性抗原呈遞途徑中與MHC-Ⅰ分子上同T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）結(jié)合的部位［3］。PSORS1 是銀屑病的一個(gè)強(qiáng)遺傳危險(xiǎn)因素，該區(qū)域的HLA-Cw6 被公認(rèn)為是與銀屑病易感基因關(guān)聯(lián)最強(qiáng)的等位基因之一。鑒于HLA-Cw6 在內(nèi)源性抗原呈遞途徑中的作用，它可能與銀屑病自身抗原有高度親和力，諸如：LL-37 與黑素細(xì)胞的抗原（ADAMTSL）5 作為自身抗原支持T 細(xì)胞在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的中心作用［4］。許瓊瓊等［5］研究發(fā)現(xiàn)HLA-C*06：02 和rs118179173 之間的顯著相互作用，以及HLA-C*06：02 與HLA-B：AA67 之間的顯著交互作用。還驗(yàn)證了先前報(bào)道的基因相互作用，其中HLA-C 和ERAP1 之間的相互作用最為顯著。

ERAP1 在內(nèi)源性抗原呈遞過(guò)程中起剪切作用，具有高度多態(tài)性，天然存在的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）稱為ERAP1 單倍型［6］。已經(jīng)有許多國(guó)內(nèi)外的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，其蛋白產(chǎn)物之間存在多種氨基酸變化，使酶構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響酶的活性和底物結(jié)合。ERAP1 不同結(jié)構(gòu)和位置的變異會(huì)導(dǎo)致異常多肽的出現(xiàn)，這些異常肽呈遞給HLA等位基因時(shí)，會(huì)影響細(xì)胞免疫表達(dá)，并激活自身炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生發(fā)展［7］。Arakawa等［8］研究發(fā)現(xiàn)ERAP1 風(fēng)險(xiǎn)單倍型增加產(chǎn)生依賴ERAP1 的自身抗原，增加了由HLA-C*06：02 呈遞黑素細(xì)胞自身抗原的可能性，從而超過(guò)潛在自身反應(yīng)性T 細(xì)胞的激活閾值，從而觸發(fā)CD8+T 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。

此外，有證據(jù)表明朗格漢斯細(xì)胞在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，具有CD1a 的組成性高表達(dá)和向T 細(xì)胞呈遞脂質(zhì)抗原的能力。自身抗原磷脂酶A2組IVD（PLA2G4D）有助于產(chǎn)生花生四烯酸等脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，參與銀屑病皮損中非蛋白脂類自身抗原的產(chǎn)生。CD1 蛋白是一類非多態(tài)性抗原呈遞分子，其編碼基因位于 MHC 基因位點(diǎn)之外，該蛋白能夠?qū)?lái)自自身和病原體的脂質(zhì)及小分子物質(zhì)作為抗原呈遞給T 細(xì)胞，并激活相應(yīng)的免疫反應(yīng)。在銀屑病患者中，血液中CD1a 限制性自身反應(yīng)性T 細(xì)胞的數(shù)量比銀屑病患者的非皮損區(qū)皮膚組織和健康對(duì)照皮膚中的增加。它們以CD1a 依賴的方式對(duì)PLA2G4D 產(chǎn)生的脂肪酸和溶血磷脂做出反應(yīng)，產(chǎn)生IL-17A、IFN-γ 和IL-22［9］。肥大細(xì)胞是PLA2G4D 的主要細(xì)胞來(lái)源，它衍生的外質(zhì)體將PLA2G4D 輸送至樹(shù)突狀細(xì)胞。這些結(jié)果指出了更廣泛的銀屑病炎癥模型，脂質(zhì)抗原在銀屑病的發(fā)展中也可能是有意義的自體抗原，外質(zhì)體可以將潛在的脂質(zhì)配體運(yùn)輸?shù)洁徑目乖蔬f細(xì)胞［10］。

先前的研究報(bào)道了HLA-C、ERAP1 的基因變異在不同人種中與PsV 關(guān)聯(lián)的不同結(jié)果，強(qiáng)調(diào)了它們?cè)谠摷膊“l(fā)病機(jī)制中的重要性［11-13］。ERAP1 基因變異僅在攜帶HLA-C 等位基因的人群中與PsV 易感性相關(guān)。遺傳研究和薈萃分析發(fā)現(xiàn)，ERAP1 基因變異與PsV 具有明顯相關(guān)性［14］。Yanjie Fu［15］等人研究發(fā)現(xiàn)ERAP1 基因上SNP rs26653 可能與中國(guó)漢族人群的PsV 易感性呈正相關(guān)。Ji Hyung Kim［16］等人通過(guò)使用CD1a 轉(zhuǎn)基因小鼠，證明了CD1a 控制銀屑病的炎癥反應(yīng)。上述遺傳學(xué)和免疫學(xué)證據(jù)均提示HLA-C、ERAP1、CD1a 是PsV 的重要關(guān)鍵分子，本研究發(fā)現(xiàn)在PsV 患者皮損中HLA-C、ERAP1、CD1a呈現(xiàn)高表達(dá)，證實(shí)3 種基因在銀屑病中的重要作用。本研究結(jié)果表明HLA-C 與CD1a 蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)，ERAP1 與CD1a 蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，提示這些基因之間存在潛在的相互作用，并非獨(dú)立發(fā)揮作用。此外我們還發(fā)現(xiàn)GPP 患者的皮損中ERAP1 也呈高表達(dá)，并且與PsV 類似，提示抗原呈遞在膿皰型銀屑病的發(fā)病機(jī)制中可能也具有重要的作用。

我們的研究顯示了HLA-C、ERAP1、CD1a 在PsV、GPP 和對(duì)照組中的蛋白表達(dá)，表明抗原呈遞相關(guān)基因與銀屑病的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。但是仍需要更深入的研究來(lái)明確它們?cè)阢y屑病發(fā)生、發(fā)展中的確切機(jī)制，以及抗原呈遞在銀屑病中的具體作用和可能的始動(dòng)因素，為以后銀屑病的預(yù)防、治療提供幫助。