熊 雪，萬麗英，向 準(zhǔn)，李 鵬*，黃 靜，和耀威

（1.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009；2.貴州省食用菌產(chǎn)業(yè)體系，貴州 貴陽 550006；3.六盤水職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤水 553001）

香菇(Lentinula edodes)屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌目(Agaricales)、小皮傘科(Marasmiaceae)、香菇屬(Lentinula)［1］。香菇清香可口，含有豐富的維生素和氨基酸，具有良好的保健功能［2-3］；香菇人工栽培已經(jīng)遍布全國，且品種繁多，市場占有率高。我國野生香菇資源豐富，主要分布在華南、華中、西南地區(qū)，大多數(shù)野生香菇較普通香菇更為鮮香［4］。馬桑香菇是一種香味濃郁、口感獨特的野生香菇，其香氣成分及氨基酸含量均遠(yuǎn)高于一般香菇，檢測發(fā)現(xiàn)其香氣成分達(dá)85種，氨基酸種類有17種［5-6］；馬桑香菇最早被發(fā)現(xiàn)于貴州省黔北地區(qū)的灌木林中［7］，是貴州特有的野生香菇資源，現(xiàn)已通過自然選育實現(xiàn)了人工栽培。但是在馬桑香菇的生產(chǎn)栽培中主要采用固體菌種，且菌棒市場價格高達(dá)8元/棒，大大限制了馬桑香菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。固體菌種在生產(chǎn)實踐中具有成本高、效率低、周期長等特點［8］，在大規(guī)模生產(chǎn)中其整體性價比不如液體菌種。周峰等［9］通過研究發(fā)現(xiàn)，使用液體菌種，以日產(chǎn)4萬個香菇菌棒為例，每年節(jié)省的菌種費用達(dá)100多萬元；使用液體菌種還具有接種方便、生產(chǎn)周期短、能耗低、庫房使用率高、出菇質(zhì)量佳等優(yōu)點［10-11］。馬桑香菇是香菇中的后起之秀，其配套栽培技術(shù)尚未成熟，在液體菌種發(fā)酵方面的研發(fā)更是空白。鑒于此，本試驗從溫度、酸堿度、礦物質(zhì)、碳源、氮源等方面探索了馬桑香菇液體菌種發(fā)酵的最優(yōu)配方，以期縮減馬桑香菇菌種生產(chǎn)的成本與時間，進(jìn)一步促進(jìn)馬桑香菇標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試馬桑香菇菌株由貴州省生物研究所分離馴化所得，現(xiàn)保藏于貴州省生物研究所。

1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，蛋白胨2 g，酵母膏2 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素B110 mg，瓊脂粉20 g，去離子水1000 mL。

液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，蛋白胨2 g，酵母膏2 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素B110 mg，去離子水1000 mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO41 g，維生素B110 mg，去離子水1000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化 將保存的馬桑香菇菌株接種于活化培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫下活化10 d。取活化的平板，使用打孔器打取直徑為5 mm的接種物；然后向100 mL液體種子培養(yǎng)基中接入5個接種物，在25 ℃下以150 r/min的轉(zhuǎn)速在搖床上避光培養(yǎng)；培養(yǎng)12 d后，用勻漿機將三角瓶內(nèi)的菌絲球攪拌30 s，使其成均質(zhì)體，備用。

1.3.2 溫度篩選試驗 在盛有100 mL液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中接入10 mL馬桑香菇種子液，每個處理3次重復(fù)。接種后分別在15、18、20、23、25、28、30 ℃溫度下，以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)8 d，最后進(jìn)行菌絲球直徑和干重的檢測。

1.3.3 酸堿度篩選試驗 在無菌環(huán)境下，在盛有100 mL液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，將pH值分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，并接入10 mL馬桑香菇種子液，每個處理3次重復(fù)。于25 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)8 d，最后進(jìn)行菌絲球直徑和干重的測定。

1.3.4 礦物質(zhì)優(yōu)化試驗 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中礦物質(zhì)(KH2PO4）為對照，分別加入礦物質(zhì)K2HPO4、MgSO4、KCl、NaCl、CaCl2、ZnSO4、FeSO4及 CuSO4，定容至1000 mL，121 ℃滅菌30 min。然后在盛有100 mL培養(yǎng)液的三角瓶中接入10 mL馬桑香菇種子液，每個處理3次重復(fù)。于25 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)8 d，最后進(jìn)行菌絲球直徑和干重的測定。

1.3.5 碳源優(yōu)化試驗 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源（葡萄糖）為對照，分別加入等量的果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘露醇及麥芽浸粉，定容至1000 mL，121 ℃滅菌30 min。其余操作同1.3.4。

1.3.6 氮源優(yōu)化試驗 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氮源（蛋白胨）為對照，分別加入等量的KNO3、尿素、玉米漿、豆粕粉、(NH4)NO3、酵母浸粉、谷氨酸、酵母膏及麥麩，定容至1000 mL，121 ℃滅菌30 min。其余操作同1.3.4。

1.3.7 通過正交試驗對液體培養(yǎng)的主要碳、氮源進(jìn)行篩選 以上述溫度、酸堿度、碳源、氮源以及礦物質(zhì)的單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，采用L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗。以培養(yǎng)基CaCl20.5 g+K2HPO40.5 g+維生素B110 mg+去離子水1000 mL（pH值為7.5）為基礎(chǔ)，選取2個適宜碳源（葡萄糖和乳糖）、2個適宜氮源（豆粕粉和玉米漿）作為試驗的4個因素，每個因素設(shè)計3個水平（表1），組合成含有不同碳源和氮源的供試培養(yǎng)基，得到9個試驗處理組，每組3個重復(fù)。其余操作同1.3.3。

表1 馬桑香菇液體菌種正交試驗因素水平 g/L

1.3.8 馬桑香菇液體菌種最佳配方的驗證試驗 經(jīng)正交試驗，得到馬桑香菇液體菌種培養(yǎng)基的最優(yōu)配方：葡萄糖30.0 g，乳糖5.0 g，豆粕粉4.0 g，玉米漿4.0 g，CaCl20.5 g，K2HPO40.5 g，維生素B110 mg，去離子水1000 mL（pH值7.5）。根據(jù)上述最優(yōu)配方配制液體菌種培養(yǎng)基，在121 ℃下滅菌30 min；然后于25 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)9 d，從培養(yǎng)后第2天開始，每天進(jìn)行1次菌絲干重及脫氫酶活力的檢測。驗證試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 項目測定及數(shù)據(jù)處理

1.4.1 菌絲球直徑的測定 隨機取30個菌絲球，在平板上排成1排，測定總長度，計算出單個菌絲球的直徑；共測量3次，取平均值。

1.4.2 菌絲球干重的測定 取100 mL發(fā)酵液，用8層紗布過濾，獲得菌絲球；用蒸餾水洗滌菌絲球3次，然后置于80 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，稱其質(zhì)量，即菌絲球干重（g/100 mL）。

1.4.3 菌絲脫氫酶活力的測定 本試驗應(yīng)用TTC-脫氫酶還原法［12］測定馬桑香菇的菌絲活力。在一定溫度下，單位時間內(nèi)形成的TF量定義為1個酶活力單位，其計算公式為：

上式中：U為酶活力［μg/(mg·h)］；CTF為生成的TF濃度(μg/mL)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得；V2為萃取劑的體積(mL)；C1為菌液的濃度(mg/mL)；V1為菌液的體積(mL)；t為反應(yīng)時間(h)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對馬桑香菇菌絲生長的影響

在所有供試溫度條件下馬桑香菇菌絲球均呈淡黃色刺狀球形，大小較為均勻。菌絲干重隨著培養(yǎng)溫度的升高而呈緩慢的先增后減趨勢（圖1），在15 ℃下菌絲干重明顯低于其他溫度下的，只有0.38 g/100 mL，其次為30、18 ℃下的；25 ℃下的菌絲干重最大（0.63 g/100 mL），顯著高于30、15 ℃下的，但與18、21、23、28 ℃下的差異不顯著。菌絲球直徑隨溫度升高呈現(xiàn)“M”形變化，2個峰值分別出現(xiàn)在18和28 ℃下。說明在供試溫度范圍內(nèi)，馬桑香菇液體菌種在21~25 ℃下的菌絲球較小且多，即馬桑香菇液體菌種發(fā)酵的適宜溫度為21~25℃，最佳溫度為23~25 ℃。

圖1 在不同培養(yǎng)溫度下馬桑香菇菌絲的生長情況

圖2 在不同pH值條件下馬桑香菇菌絲的生長情況

2.2 酸堿度對馬桑香菇菌絲生長的影響

在供試酸堿度范圍內(nèi)，菌絲球均呈淡黃色刺狀球形，大小較為均勻，當(dāng)pH值為6.0時，菌絲球長勢最好，大小均勻度最高。當(dāng)pH值為6.5時，菌絲球干重最大，達(dá)0.647 g/100 mL；其次為pH值6.0、7.0；而當(dāng)pH值為9.0時，菌絲球干重最小，只有0.573 g/100 mL，顯著低于pH值6.0~7.0下的。菌絲球直徑在pH值6.5下顯著大于其他pH值條件下的；當(dāng)pH值達(dá)到9.0時菌絲球直徑最小(3.5 mm)，顯著小于其他酸堿度條件下的；除了pH值6.5、9.0外，在其他6個pH值條件下菌絲球直徑差異不顯著，說明馬桑香菇菌絲對酸堿度的適應(yīng)能力強，在供試酸堿度范圍內(nèi)均能較好地生長。結(jié)合菌絲長勢可知，馬桑香菇液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)的適宜pH值為6.0~7.0，且以pH值6.0為最佳。

2.3 礦物質(zhì)對馬桑香菇菌絲生長的影響

如表2、圖3所示，馬桑香菇液體菌種在培養(yǎng)中菌絲生長受培養(yǎng)基中礦物質(zhì)的影響較大，在不同礦物質(zhì)添加條件下菌絲形態(tài)差異較大，但菌絲球直徑整體偏大，在不同礦物質(zhì)條件下差異不顯著。在所有供試礦物質(zhì)中，添加CaCl2和K2HPO4有助于馬桑香菇菌絲的生長，菌絲干重分別達(dá)到了0.41和0.33 g/100 mL，且菌絲球數(shù)量多于其他礦物質(zhì)條件下的。其次為添加MgSO4和KH2PO4處理，菌絲干重分別達(dá)到了0.31和0.30 g/100 mL。在添加礦物質(zhì)CuSO4的條件下培養(yǎng)，菌絲干重最低（0.08 g/100 mL），且菌絲球少，大小不均勻，長勢差。綜上可知，在供試的礦物質(zhì)中，添加CaCl2和K2HPO4能更好地促進(jìn)馬桑香菇的菌絲生長，MgSO4和KH2PO4次之。

圖3 在不同礦物質(zhì)添加條件下馬桑香菇菌絲的生長情況

表2 在不同礦物質(zhì)添加條件下馬桑香菇菌絲的生長情況

2.4 碳源對馬桑香菇菌絲生長的影響

如表3、圖4所示，當(dāng)以糊精為碳源時，馬桑香菇菌絲干重顯著大于其他碳源培養(yǎng)的，其次為葡萄糖、麥芽浸粉和甘露醇；當(dāng)碳源為可溶性淀粉、乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖時，菌絲干重均較小，且彼此間差異不顯著。當(dāng)以糊精、麥芽浸粉為碳源時，菌絲球直徑顯著大于其他碳源培養(yǎng)的；以糊精為碳源時菌絲球大小不均勻，培養(yǎng)液較為渾濁；當(dāng)以葡萄糖、果糖和乳糖為碳源時，菌絲球直徑小，數(shù)量較多且大小較為均勻，其中以乳糖為碳源時馬桑香菇菌絲的整體長勢最好。因此，在供試碳源中，馬桑香菇液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)以乳糖、葡萄糖及果糖更為適宜。

圖4 不同碳源培養(yǎng)下馬桑香菇菌絲的生長情況

表3 在不同碳源培養(yǎng)下馬桑香菇菌絲的生長情況

2.5 氮源對馬桑香菇菌絲生長的影響

如表4、圖5所示，馬桑香菇在10種供試氮源培養(yǎng)下均能正常生長，但菌絲的長勢有差異。當(dāng)以豆粕粉、麥麩為氮源時，馬桑香菇的菌絲干重顯著高于其他氮源培養(yǎng)的，分別達(dá)0.49和0.39 g/100 mL；在這2種氮源培養(yǎng)條件下，菌絲球直徑也顯著大于其他氮源培養(yǎng)的，分別達(dá)6.91和6.66 mm，且菌絲球數(shù)量多，但菌絲球大小均勻度不夠。當(dāng)以尿素為氮源時，菌絲球數(shù)量最少，直徑最小且干重最低，說明馬桑香菇對氮源尿素吸收不良。當(dāng)以硝酸鉀和谷氨酸為氮源進(jìn)行培養(yǎng)時菌絲球干重略高于氮源尿素培養(yǎng)的，但在0.05水平上差異不顯著，且菌絲球數(shù)量較多、較均勻。當(dāng)以蛋白胨、玉米漿、硝酸銨、酵母浸粉、酵母膏為氮源進(jìn)行培養(yǎng)時，菌絲球干重在0.05水平上差異不顯著，其中以硝酸銨、酵母浸粉為氮源進(jìn)行培養(yǎng)時菌絲球數(shù)量較少，以玉米漿、酵母膏為氮源進(jìn)行培養(yǎng)時菌絲球數(shù)量多，以玉米漿為氮源培養(yǎng)時菌絲球大小最均勻。綜合而言，馬桑香菇對有機氮蛋白胨、玉米漿、豆粕粉、酵母浸粉、酵母膏和麥麩的吸收情況優(yōu)于無機氮硝酸鉀、尿素和硝酸銨的，且馬桑香菇液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)的最適氮源為豆粕粉、麥麩和玉米漿，其中以玉米漿最佳。

圖5 在不同氮源培養(yǎng)下馬桑香菇菌絲的生長情況

表4 在不同氮源培養(yǎng)下馬桑香菇菌絲的生長情況

2.6 正交試驗結(jié)果分析

選取適宜的碳源（乳糖、葡萄糖）和適宜的氮源（玉米漿、豆粕粉）建立 L9（34）正交表，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗，發(fā)現(xiàn)馬桑香菇在9個碳氮源配方中均能較好地生長，菌絲球為刺狀球形，數(shù)量多，大小均勻度高，菌絲球直徑小，且各配方處理的菌絲球直徑在0.05水平上無顯著差異（表5和圖6）。在Y7配方下，馬桑香菇的菌絲球干重明顯高于其他配方的，達(dá)0.86 g/100 mL，說明在供試的9種碳氮濃度配方中，Y7（A3B1C3D2）配方中的碳、氮源最適于馬桑香菇的吸收利用。

圖6 在不同碳、氮濃度下馬桑香菇菌絲的生長情況

表5 在不同碳、氮濃度下馬桑香菇菌絲的生長情況

對4個因素進(jìn)行主體間效應(yīng)的檢驗分析，結(jié)果（表6）表明：PB＜PD＜PA＜PC，且因子B（乳糖）和因子D（玉米漿）對菌絲干重有極顯著的影響（P＜0.01），而因子A（葡萄糖）和因子C（豆粕粉）對菌絲干重影響不顯著。

表6 馬桑香菇正交試驗主體間效應(yīng)的檢驗結(jié)果

從表7可以看出，4個因素的R值表現(xiàn)為RB＞RD＞RC＞RA，表明4個因素對馬桑香菇菌絲干重的影響力度次序為B（乳糖）＞D（玉米漿）＞C（豆粕粉）＞A（葡萄糖），該結(jié)果與表6所得結(jié)果基本一致。按照各因素的最優(yōu)水平，得到A3B1C1D3組合為本試驗的最優(yōu)碳氮配方組合，即葡萄糖30.0 g+乳糖5.0 g+豆粕粉1.0 g+玉米漿4.0 g。但該組合并不在試驗處理中，故需要進(jìn)行驗證試驗。

表7 碳、氮源對馬桑香菇菌絲生長影響的正交試驗分析結(jié)果

2.7 馬桑香菇液體菌種培養(yǎng)最優(yōu)配方的驗證

采用上述正交試驗所得的最優(yōu)配方，進(jìn)行驗證試驗。結(jié)果顯示：馬桑香菇菌絲隨培養(yǎng)時間的增加而累積，菌絲球干重在培養(yǎng)前期增加迅速，培養(yǎng)5 d后開始趨于平緩，但未出現(xiàn)減少情況，最大菌絲干重達(dá)0.88 g/100 mL（圖7）。TTC-脫氫酶活力隨培養(yǎng)時間的增加而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且在培養(yǎng)后第4 天達(dá)到峰值［292.15 μg/(mg·h)］。說明該優(yōu)化配方中的碳、氮源能被馬桑香菇較好地吸收利用，采用該配方能縮短馬桑香菇菌種的培養(yǎng)時間。

圖7 馬桑香菇液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)中菌絲球干重及菌絲脫氫酶活力的變化

3 討論與小結(jié)

自1948年美國的Humfeld［13］揭開食用菌液體發(fā)酵研究的序幕后，液體菌種發(fā)酵技術(shù)隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展而得到了快速的推廣，在多種食用菌規(guī)模化、工廠化栽培中逐步取代了傳統(tǒng)固體菌種培養(yǎng)模式，如香菇、平菇、金針菇、杏鮑菇、蟲草、黑木耳及草菇等［14-20］。與固體菌種相比，采用液體菌種不但可以降低成本、縮短周期，還具有接種方便、污染率低、萌發(fā)點多、生長快、出菇整齊、成品率高等優(yōu)點［11］，因此采用液體菌種是香菇大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。馬桑香菇是一種極受歡迎的野生鮮香食用菌，開發(fā)價值高。雖然目前已實現(xiàn)人工栽培，但馬桑香菇菌棒成本高、周期長、產(chǎn)量低的瓶頸仍有待破解。本試驗結(jié)果顯示，馬桑香菇液體菌種發(fā)酵的最佳溫度為23~25 ℃，適宜pH值為6.0~7.0，最適礦物質(zhì)為CaCl2和K2HPO4，最佳碳源為乳糖、葡萄糖、果糖，最佳氮源為豆粕粉、麥麩、玉米漿。馬桑香菇液體菌種對溫度的適應(yīng)性與其他香菇菌株大體相當(dāng)［21-22］；本試驗研究結(jié)果與熊雪等［23］對馬桑香菇菌絲在固體平板上的生長條件研究結(jié)果較為一致。香菇菌絲適于在酸性環(huán)境下生長，菌絲一般在pH值4.0~5.5條件下生長最佳［24-25］，而馬桑香菇菌絲生長更傾向于弱酸性和中性環(huán)境。馬桑香菇在固體平板培養(yǎng)時最佳碳、氮源分別為蔗糖和蛋白胨［23］；但在本試驗的液體發(fā)酵培養(yǎng)中，馬桑香菇對這2種物質(zhì)的吸收能力一般，對單糖碳源的吸收能力更強；相對于無機氮源，豆粕粉、玉米漿、麥麩、酵母膏等有機氮源無論是在固體平板還是在液體發(fā)酵培養(yǎng)下均能被更好地分解和吸收，而氮源尿素則很難被馬桑香菇吸收，這可能是因為豆粕粉、玉米漿、麥麩、酵母膏等復(fù)雜有機氮還可以作為碳源被利用，有利于香菇的營養(yǎng)平衡及物質(zhì)轉(zhuǎn)化［26］。香菇液體菌種發(fā)酵技術(shù)已日漸成熟，很多學(xué)者對國內(nèi)市場上不同香菇菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)的適宜配方進(jìn)行過篩選。例如：徐思煒等［27］通過試驗篩選，確定了香菇液體菌種培養(yǎng)的優(yōu)勢碳、氮源分別為麥芽糖與麥麩；王紅等［28］在對香菇液體菌種配方的研究中確定了優(yōu)勢碳、氮源分別為碳源紅糖、蔗糖和氮源麥麩、牛肉膏；覃寶山等［29］在對香菇液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)基主要營養(yǎng)物質(zhì)篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗中篩選出最優(yōu)碳、氮源分別為葡萄糖和蛋白胨；鹿桂花等［30］對武香一號香菇液體菌種的搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出優(yōu)勢碳、氮源分別為碳源麥芽糖、葡萄糖和氮源酵母浸粉、牛肉膏；謝婷等［31］在對香菇“森源16”菌株液體菌種培養(yǎng)基及搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究中確定了該菌株的最佳碳、氮源分別為棉稈粉和麩皮；李春霞等［24］在對香菇0912液體菌種培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件的篩選中發(fā)現(xiàn)碳源葡萄糖和氮源玉米漿、麥麩更易被吸收。由于各試驗的香菇菌株以及供試碳、氮源均有所差異，因此所得結(jié)果也有所不同，但整體而言，大多數(shù)香菇菌株都能較好地吸收利用碳源葡萄糖和氮源麥麩。周韜［32］也證實了香菇L808液體菌種能較好地吸收氮源麥麩，但氮源豆粕粉較麥麩更能促進(jìn)該菌種菌絲生物量的積累，這與本研究馬桑香菇培養(yǎng)的氮源選擇結(jié)果相近。

經(jīng)過正交試驗分析，本研究得到了馬桑香菇液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)配方：葡萄糖30.0 g，乳糖5.0 g，豆粕粉1.0 g，玉米漿4.0 g，CaCl20.5 g，K2HPO40.5 g，維生素B110 mg，去離子水1000 mL（pH值為6.0）。在該配方下馬桑香菇菌絲球小而多，且所耗碳、氮源成本低，生產(chǎn)方便；合理應(yīng)用該配方能縮減馬桑香菇制種和制棒的時間和成本，有助于加快液體菌種產(chǎn)業(yè)制種工藝的轉(zhuǎn)型升級，從源頭上解決制約馬桑香菇產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；钠款i問題，從而推進(jìn)馬桑香菇產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。