馬心萍，朱 迪，賀苗苗,2,3

（1.青海大學(xué)/青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青藏高原生物技術(shù)教育部重點實驗室，青海 西寧 810016；3.青海省馬鈴薯育種重點實驗室/西北馬鈴薯教育部工程研究中心，青海 西寧 810016)）

馬鈴薯是世界四大主糧作物之一，作為人類的重要膳食來源，其富含淀粉、蛋白質(zhì)、VC、VB以及各種礦物質(zhì)元素［1］。除了黃色、白色的馬鈴薯品種以外，還有粉紅色、紅色、藍色、黑色、紫色等多種色彩皮肉的馬鈴薯，這些馬鈴薯被稱為彩薯或特色馬鈴薯［2］。彩色馬鈴薯除了具有普通馬鈴薯含有的營養(yǎng)物質(zhì)外，還富含類黃酮物質(zhì)，如兒茶素、表兒茶素及花青素等多種有功效的物質(zhì)［3］。花青素在很多行業(yè)中均具有很重要的應(yīng)用價值，在食品行業(yè)中被當作天然色素廣泛應(yīng)用；在醫(yī)療、保健品行業(yè)，因其具備抗氧化、抗病毒等諸多功能而使其應(yīng)用前景十分廣闊［4］?；ㄇ嗨刭x予了馬鈴薯豐富的色彩，彩色馬鈴薯中富含的花青素不僅能夠抑制炎癥，增強血管的彈性和關(guān)節(jié)的柔韌性，而且還可以提高肝臟的抗氧化酶活性，防止因高脂而導(dǎo)致氧化損傷，并且能夠降低人體內(nèi)的膽固醇含量［5］。此外，花青素還能明顯抑制人體的腫瘤細胞，延緩人體衰老、降低血糖含量、抵抗癌細胞的產(chǎn)生等［6-8］，對人體具有良好的保健作用。

花青素是可溶于水的天然色素，它廣泛存在于高等植物中，是植物次生代謝的一類產(chǎn)物，屬于黃酮類化合物，通常通過糖苷鍵而形成花色苷［9-10］。植物中最常見的花青素主要有6種：天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥花色素、牽牛花色素和錦葵色素?；ㄇ嗨卦诤铣傻倪^程中會受到2種基因的影響，一類是調(diào)節(jié)基因，通過所編碼的轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH和WD40調(diào)控結(jié)構(gòu)基因，進而影響花青素的生物合成［11］；另一類為結(jié)構(gòu)基因，該基因主要編碼花青素生物合成途徑中所需要的酶，主要有PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、DFR、UF3GT和ANS等基因。

查爾酮異構(gòu)酶(CHI)在花青素的合成過程中起著非常關(guān)鍵的限速作用，它能使查爾酮異構(gòu)化為柚皮素，再經(jīng)過其他酶的催化，促使花色素及相關(guān)黃酮類物質(zhì)的積累［12］。經(jīng)過研究得出，CHI的基因結(jié)構(gòu)具有家族特異性，可分為2種類型：Ⅰ型CHI，通常是指在非豆類中發(fā)現(xiàn)的CHI僅將6′-羥基查爾酮催化形成5′-羥基黃酮醇；Ⅱ型CHI，它是迄今發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)豆科植物的CHI催化6′-脫氧查爾酮和6′-羥基查爾酮分別產(chǎn)生異黃酮和類黃酮［13］。CHI最早是在大豆中被發(fā)現(xiàn)的，隨后從法國豌豆中克隆得到該基因［14-15］。迄今為止，已從許多高等植物中克隆出編碼CHI的cDNA序列，如矮牽牛［16］、玉米［17］、水母雪蓮［18］和花生［19］等。CHI在含有豐富類黃酮或花青素的植物組織中表現(xiàn)出高的表達水平，如在番茄和突變水稻中過表達CHI基因，在轉(zhuǎn)基因番茄果實和突變水稻外殼中類黃酮的積累有所增加［20-22］。在白色矮牽牛中過表達CHI基因，使白色花瓣顏色加深而呈現(xiàn)淺粉紅色［23］。相反，在煙草中通過RNAi技術(shù)對CHI的抑制使得花瓣色素沉著降低并改變了花瓣中的類黃酮成分［24］。降低翠菊、康乃馨、仙客來的CHI酶活性，將導(dǎo)致植物體內(nèi)的查爾酮不能進一步催化形成柚皮素，從而積累大量的查爾酮而使花朵顏色變黃［25-27］。盡管CHI基因在許多作物中已有研究，但有關(guān)馬鈴薯CHI基因的研究未見報道。本研究根據(jù)紫色馬鈴薯品系“15-12-16”和白色馬鈴薯品種“下寨65”轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，篩選出在薯肉中表達量顯著的基因，即StCHI，以馬鈴薯品系“15-12-16”為材料，將該基因予以克隆并使用生物信息學(xué)的方法，對合成花青素時查爾酮異構(gòu)酶基因所發(fā)揮的作用進行分析，為培育出多色馬鈴薯以及多種天然色素的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯“15-12-16”由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供；植物總 RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、試驗所需的熒光定量試劑等均購買自TaKaRa公司；根據(jù)NCBI 網(wǎng)站下載 StCHI(XM_0063 65267.2)基因CDS序列，利用Primer 3在線網(wǎng)站設(shè)計特異性引物(StCHI-F：5′-AAAAAGCAGGCTTC ATGGTAAAGAATGAAGTGATGGT-3′；StCHI-R：5′-AGAAAGCTGGGTCTTATTTAGACAATTCAA CACAA-3′)，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 馬鈴薯總RNA的提取與cDNA的合成

采用天根生化科技(北京)有限公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取馬鈴薯“15-12-16”塊莖中的總RNA，利用超微量分光光度計(Thermo scientific)檢測RNA濃度，以無菌水為空白對照。并通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，電壓為160 V、電泳時間8 min。以提取的RNA為模板，按照PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。

1.3 StCHI基因的克隆

將馬鈴薯品系“15-12-16”中提取到的RNA進行反轉(zhuǎn)錄后，可得到cDNA模板，并以此擴增PCR。擴增反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1.0 μL，StCHIF、R各0.5 μL，Premix Taq?10. 0 μL，ddH2O 8.0 μL。PCR反應(yīng)程序為：98 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；72 ℃40 s，4 ℃，共32個循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物，目的條帶與預(yù)期條帶符合后切膠回收，然后將膠回收產(chǎn)物與pDONR207載體連接，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E. coli DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含慶大霉素(Gen)的 LB平板上，倒置于37℃恒溫箱中暗培養(yǎng)12 h，從中選出單克隆菌，使用PCR技術(shù)對其進行篩選，并將陽性菌送到基因檢測有限公司進行測序。

1.4 StCHI基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件對StCHI基因所編碼的氨基酸序列進行分析研究；利用Expasy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protscale、https://web.expasy.org/prot-param)分析StCHI蛋白的理化性質(zhì)。利用互聯(lián)網(wǎng)站PtedichProtihoy (https://PtedichProtihoy.ohy)預(yù)測基因亞細胞定位。利用Ongoing maintenance(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)和DeepTMHMM (https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM)在線軟件預(yù)測蛋白信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)。通過SOPMA網(wǎng)站(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析StCHI蛋白的二級結(jié)構(gòu)；通過NCBI分析該基因的保守結(jié)構(gòu)域，查找StCHI蛋白與其他物種同源蛋白質(zhì)序列進行多重比對，通過MEGA 11.0軟件的鄰近法構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.5 StCHI基因表達分析

分別提取馬鈴薯“15-12-16”的根、莖、葉、花瓣、薯皮、薯肉的總RNA，并以熒光反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，設(shè)計熒光定量引物：StCHI-F：5′-GCCAT ACGCGATCGCTTAGC-3′；StCHI-R：5′-CTTTGC ACTCCCAGAAGTAGCTG-3′，以馬鈴薯X83206為內(nèi)參基因：StActin-F：5′-AGATGCTTACGCTGGA TGGAATGC-3′；StActin-R：5′-TTCCGGTGTGGT TGGATTCTGTTC-3′。參考TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ(Tli RNaseH Plus)熒光定量試劑盒說明書，反應(yīng)體系(20 μL)為TB Green premix Ex Taq?Ⅱ 10 μL、F/R各0.2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 7.6 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，58.9 ℃ 32 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 60 s；58.9 ℃ 60 s；55 ℃ 10 s。使用2-ΔΔCt方式處理和分析試驗所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 StCHI基因的克隆

以馬鈴薯“15-12-16”塊莖RNA(圖1A)反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進行PCR擴增，得到目的基因片段(圖1B)。將目的片段回收純化，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化、測序，結(jié)果表明：StCHI的CDS長度為633 bp。

圖1 馬鈴薯“15-12-16”塊莖總RNA和StCHI基因擴增

2.2 StCHI基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 StCHI蛋白的理化性質(zhì)分析 通過Expasy在線分析得到，該基因共編碼210個氨基酸，其中谷氨酸(Glu)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)的含量較高，分別占12.4%、9.5%、8.6%(圖2)。該蛋白分子量為23.852 kDa，為不穩(wěn)定的親水性蛋白，理論等電點(pI)為4.75，脂溶性指數(shù)為91.81(圖3)。通過在線網(wǎng)站PredictProtein預(yù)測StCHI亞細胞定位在葉綠體中。

圖2 StCHI基因的核苷酸序列與蛋白序列

圖3 StCHI蛋白的親疏水性

2.2.2 StCHI蛋白信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 利用在線預(yù)測蛋白信號肽網(wǎng)站對StCHI蛋白的信號肽進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該蛋白無信號肽，無切割位點，為非分泌蛋白(圖4)。之后，又利用跨膜區(qū)域預(yù)測網(wǎng)站分析該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白均在膜內(nèi)，無跨膜螺旋區(qū)結(jié)構(gòu)。由以上結(jié)果推斷出該蛋白不屬于信號蛋白(圖5)。

圖4 StCHI蛋白信號肽

圖5 StCHI蛋白跨膜區(qū)域

2.2.3 StCHI蛋白二三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 通過SOP MA在線預(yù)測分析得到StCHI蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、延伸鏈、無規(guī)則卷曲組成。其中，α-螺旋所占比例最高，為43.81%，無規(guī)則卷曲、延伸鏈、β-折疊分別占25.24%、23.33%、7.62%(圖6)。無規(guī)則卷曲能夠決定蛋白質(zhì)的功能，其所含的α-螺旋還能使蛋白質(zhì)骨架更加穩(wěn)定，酶的功能部位常常位于這種區(qū)域中［28］。StCHI蛋白的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占比次之，這表明該基因可能會促進花青素的生物合成。

圖6 StCHI蛋白的二級結(jié)構(gòu)

StCHI 蛋白三級結(jié)構(gòu)以AtCHIL(Arabidopsis thaliana chalcone-isomerase like protein At5g05270)為模板，GMQE (Global model quality estimation)為0.87，兩者相似度為64.71%，說明該結(jié)構(gòu)模型質(zhì)量較高，可進行后續(xù)分析(圖7)。

圖7 StCHI蛋白的三級結(jié)構(gòu)

2.2.4 StCHI蛋白保守域及進化樹分析 通過NCBI Conserved DomainSearch分析，發(fā)現(xiàn)StCHI基因編碼的蛋白屬于Chalcone 3超家族，具有一個查爾酮異構(gòu)酶特異位點(PLN02804)，保守結(jié)構(gòu)域分布在第19~209位氨基酸之間，這表明該基因?qū)儆诓闋柾悩?gòu)酶家族(圖8)。

圖8 StCHI蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

通過NCBI獲得了不同物種中StCHI基因編碼的蛋白序列并進行了多重比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：StCHI蛋白分別與風鈴辣椒(Capsicum baccatum)、黃辣椒(Capsicum chinense)、黃果枸杞(Lycium barbarum var.auranticarpum)、黑果枸杞(Lycium ruthenicum)、枸杞(Lycium chinense)的CHI蛋白質(zhì)具有92.31%、91.83%、90.43%、89.47%、89.05%的同一性。利用MEGA 11.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建了StCHI蛋白與其他10種物種的CHI蛋白系統(tǒng)進化樹，分析進化樹發(fā)現(xiàn)StCHI與同一茄科的風鈴辣椒、黃辣椒、黃果枸杞、黑果枸杞、枸杞親緣關(guān)系較近屬于同一個分支，與其他科的親緣關(guān)系較遠(圖9)。

圖9 馬鈴薯StCHI蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

2.3 StCHI基因表達模式分析

利用qRT-PCR技術(shù)對StCHI在馬鈴薯“15-12-16”的根、莖、葉、花瓣、薯皮、薯肉中進行了相對表達量的測定(圖10)。試驗結(jié)果表明，StCHI基因在“15-12-16”的各組織中都有所表達，說明StCHI基因具有組織特異性。并且在花瓣中含量最多，其次為葉和莖，在根中表達水平最低，各組織間表達量存在顯著差異。這可能與CHI基因主要在花冠及花藥中表達［29］有關(guān)。

圖10 StCHI基因在“15-12-16”不同組織中的表達量

3 結(jié)論與討論

CHI是植物花青素生物合成途徑第2階段中所需的關(guān)鍵酶，因此，CHI基因的克隆及其功能的挖掘，在研究彩色馬鈴薯花青素的合成及調(diào)控機制的方面具有重要的意義。通過對一系列結(jié)構(gòu)基因的克隆，不斷深入研究花青素生物合成的調(diào)節(jié)機制，以及如何培育出多種彩色馬鈴薯。本研究克隆了紫色馬鈴薯“15-12-16”中的StCHI基因，該基因的CDS長度為633 bp并編碼210個氨基酸。對該基因編碼中存在的蛋白質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)在該序列中存在CHI基因，并且家族結(jié)構(gòu)特征區(qū)域位于第19~209位氨基酸之間，表明該基因編碼的蛋白是具有生物功能的蛋白。

紫色馬鈴薯的CHI基因是獨特的，由于它沒有內(nèi)含子。而來自其他植物的CHI基因，如日本蓮［13］、矮牽牛［16］、玉米［17］、水稻和大麥［30］，每個都有2個或3個內(nèi)含子。由于內(nèi)含子可能在基因表達中具有一些調(diào)節(jié)功能，并且能夠影響植物的生長，但CHI基因是否具有內(nèi)含子仍有待研究。通過對基因序列進行比對可以發(fā)現(xiàn)，StCHI與辣椒、枸杞等的同源性較高，根據(jù)CHI基因在物種進化上的高度保守性，推斷其編碼的蛋白也能使查爾酮轉(zhuǎn)化為有生物活性的黃烷酮，與其他物種已明確的CHI基因的功能具有相似之處［13］。張水明等［31-32］研究發(fā)現(xiàn)，查爾酮異構(gòu)酶處于類黃酮化合物生物合成途徑的上游，且在生命活動較旺盛的器官中該基因的表達量相對較高，使它在黃酮類化合物進行合成時發(fā)揮作用。通過對基因的表達量進行分析，可以發(fā)現(xiàn)在花器官中該基因的表達量最多，說明CHI基因?qū)χ参锍缮梢赃M行調(diào)控，該結(jié)論同周興文等［33］的研究結(jié)論相符。本研究克隆和分析了StCHI基因相關(guān)的理化性質(zhì)及表達模式，為進一步研究該基因在馬鈴薯花青素合成途徑的調(diào)控以及在表達機制方面的研究提供理論依據(jù)與基礎(chǔ)，后續(xù)將對該基因的功能展開更深入的探究。