欒海萍

上海市普陀區(qū)婦嬰保健院檢驗科 200062

聽力障礙是最常見的出生缺陷之一,國內(nèi)外報道發(fā)生率為1‰～3‰,經(jīng)過ICU搶救過的新生兒發(fā)生率更高。若是按照我國每年出生1 900萬新生兒計算,每年新增2萬～3萬聽力障礙兒童[1-4]。聽力障礙后果不僅在于“聾”,而且在于“啞”,特別是遲發(fā)性耳聾發(fā)病率高,在新生兒中發(fā)病率為1.33‰,4歲兒童的發(fā)病率為2.7‰,青少年中為3.5‰。研究發(fā)現(xiàn)我國耳聾基因的熱點譜存在地域差異性[5],本研究以近年來出生的2 916例新生兒為研究對象,采用PCR擴增法和導流雜交相結合的方法,對耳聾基因GJB2、GJB3、SLC26A4、mtDNA的13個位點進行檢測。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2018年6月—2022年6月在我院出生的2 916例新生兒為研究對象,其中男1 516例,女1 400例。新生兒家長均在新生兒科醫(yī)生充分告知的情況下,自愿簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集：由新生兒醫(yī)生采集,采集新生兒腳底末梢血制成血斑卡,晾干后每張血斑卡使用獨立的自封卡,送至檢驗科標本接收處,通過簽收血斑卡保證檢驗前質(zhì)量控制。

1.2.2 核酸提?。翰捎么蚩灼鲗ρ呖ň鶆虼蛉?～4個干血片置于1.5ml離心管中,采用凱普生物全血細胞DNA提取試劑盒的離心柱法提取DNA。

1.2.3 核酸擴增及導流雜交：對13個GJB2(35delG、176-191del16、235delC、299-300delAT、155delTCTG),SLC26A4(2168A>G,IVS7-2A>G、1229C>T),GJB3(538C>T),mtDNA(1494C>T、1555A>G、12201T>G、7445A>G)基因位點設計引物,采用PCR擴增儀為Bioer Life Express進行擴增反應。并對擴增反應物通過變性,對變性產(chǎn)物用核酸分子雜交儀HB-2012A雜交反應,并設置相應質(zhì)控點,保證雜交質(zhì)量。

1.2.4 驗證方法：為保證結果的準確性,雜合突變采用重新提取DNA復查的辦法,純合突變和異常突變(正常點和突變點均未顯色)Sanger測序。使用聚合酶鏈式反應技術(PCR)對突變基因目標位置進行擴增,并采用特異性引物進行 Sanger 測序檢測。特異性引物的設計是專門針對目標位點,并覆蓋該位點上下游的序列;標本檢測得到的序列與 NCBI 所提供 基因參考序列進行比對和注釋。突變的表述參照 Human Genome Variation Society (HGVS) version 15.11進行。

1.2.5 質(zhì)量控制：采用空白對照作為陰性質(zhì)控﹑以往陽性標本作為陽性質(zhì)控監(jiān)測擴增過程,雜交過程由生物素標記點作為監(jiān)測。并參加上海市臨檢中心室間質(zhì)控作為實驗室質(zhì)量保證。

2 結果

2.1 篩查結果分析 2 916例新生兒共篩查出138例耳聾基因突變,總陽性率為4.7%,GJB2-235基因突變率最高。上海普陀地區(qū)常見的耳聾基因GJB2和SLC26A4,熱點突變位點是GJB2的235delC、SLC26A4的IVS7-2A>G位點。其他復合突變：mtDNA-1555純合突變、SLC26A4-IVS7-2雜合突變的復合突變。GJB2-235的雜合突變、SLC26A4-IVS7-2雜合突變的復合突變。見表1。

表1 2 916例新生兒耳聾基因篩查突變表

2.2 異常突變點一代測序驗證結果 在2 916例標本中,有6例異常突變的標本,分別是1.7445正常點和雜合突變點均未顯色,Sanger測序為7443均質(zhì)突變,其突變影響了探針結合,該突變?yōu)闊o義突變,不致病。2.1494正常點和雜合點未出,Sanger測序為1503處發(fā)生均質(zhì)突變。3.7445正常點顯色很淡,Sanger測序為7443(A>G)的多態(tài)性。4.1494和1555正常點顯色很淡,Sanger測序為mtDNA m.1709G>A和m.1716T>C均質(zhì)突變,致病性不明。1494位點和1555位點未見突變。5.7445正常點和雜合突變點均未顯色,Sanger測序為7443A>G,其突變影響了7445探針結合,該突變致病性不明,見圖1。6.1494點淡,測序顯示多態(tài)性。

圖1 mtDNA基因7445位點測序圖

2.3 純合突變一代測序驗證結果 在2 916例標本中,有7例純合突變,一代測序驗證情況均符合雜交結果,其中1例GJB2-235純合突變,通過隨訪發(fā)現(xiàn)該新生兒兩耳聽力未過。由于該突變一般無法通過物理聽力篩查,聽力基本喪失,經(jīng)確診后建議進行干預治療(佩戴助聽器,人工耳蝸植入術)。此外,做好婚育或產(chǎn)前遺傳咨詢,即將來其配偶也應進行婚育前耳聾基因檢測,必要時可進行產(chǎn)前診斷以確認后代耳聾基因的攜帶情況。由于我院沒有耳鼻喉科,故轉(zhuǎn)診到上級醫(yī)院進行隨訪,后續(xù)隨訪結果為盡快植入人工耳蝸。其余6例聽力篩查均通過,線粒體DNA均質(zhì)突變患者應終生禁用耳毒性藥物,見圖2、3。

圖2 導流雜交膜條

圖3 耳聾基因mtDNA1555均質(zhì)突變測序圖

3 討論

聽力障礙作為殘障性疾病,在新生兒群體中較常見。新生兒聽力篩查作為新生兒重點篩查疾病之一,衛(wèi)生部于2010年頒布的《新生兒聽力篩查技術規(guī)范》中提出,應盡早發(fā)現(xiàn)聽力障礙個體,予以及時、有效干預,以防聾致啞[6]。近年來,隨著新生兒聽力篩查的研究不斷深入,發(fā)現(xiàn)單純聽力篩查可

能造成藥物性耳聾基因攜帶者以及遲發(fā)性耳聾患兒的漏診,因此,自2007年臨床推薦在常規(guī)聽力篩查基礎上應聯(lián)合基因篩查。遺傳性耳聾分為綜合征性耳聾和非綜合征性耳聾,其中非綜合征性耳聾約占70%。根據(jù)流行病學調(diào)查,非綜合征性耳聾絕大多數(shù)為單基因遺傳病,我國非綜合性耳聾主要由GJB2、GJB3、SLC26A4、mtDNA引起[7-9],所以針對新生兒的耳聾基因和聽力篩查可以了解他們是否攜帶耳聾基因和聽力損失情況。通過進一步檢測來決定是否需要干預性治療,讓兒童不錯過學習語言的最佳時期。由于聽力下降是一個過程,所以對于純合突變和復合雜合突變的病例,也應建議進一步進行耳鼻喉科的隨訪。耳聾嚴重影響個人的生活質(zhì)量,降低生活幸福指數(shù)。

在2 916例耳聾基因篩查中,總陽性率為4.7% ,陽性位點攜帶率與國內(nèi)文獻基本接近[10-11]。巫靜帆等[12]對33 810例新生兒聽力篩查與聾病易感基因篩查進行分析時發(fā)現(xiàn),GJB-2基因突變發(fā)生率最高,為1.96%。另一項研究顯示GJB-2基因突變率最高,突變頻率為2.57%,GJB2純合突變引起的先天性重度耳聾使用耳蝸干預性治療,效果良好[13]。本研究中,GJB-2基因突變點最高,為2.1%,雜合突變點共61例,其結果與之相符。SLC26A4基因突變率為1.37%,該基因即“一巴掌致聾”,帶有該基因的病人應避免外力碰撞對耳朵的傷害。研究表明,SLC26A4基因是僅次于GJB-2基因突變所致的感音神經(jīng)性聾的遺傳學病因[14]。SLC26A4基因突變與大潛艇導水管綜合征存在密切關聯(lián),其典型表現(xiàn)為前庭導水管擴大,同時伴有感音神經(jīng)性或混合性耳聾,其純合突變、雙雜合突變均是致聾的重要因素。GJB-3基因是國內(nèi)本土克隆和鑒定的第一個遺傳聾病基因,易引起遲發(fā)性聾病,多數(shù)患者在青年時期表現(xiàn)為聽力正常,隨著年齡增長進入青壯期聽力逐漸降低,直至發(fā)展為重度聾病,其基因突變的原因與高頻聽力下降相關。李欣欣[15]研究結果顯示,GJB-3基因突變?yōu)?.27%,該研究證實該基因為常染色體顯性遺傳,攜帶此基因新生兒應長期監(jiān)測聽力問題,以便盡早發(fā)現(xiàn)聽力異常。本研究中,GJB-3基因突變率為0.44%,耳聾基因突變被證實與高頻聽力下降有關,一般發(fā)病為青少年期或者成人期,是一種遲發(fā)性耳聾基因。mtDNA基因?qū)倌赶颠z傳,常見的兩種突變類型為1494C和1555A,且存在同質(zhì)性和異質(zhì)性突變,兩種突變本研究中突變率為0.23%,帶有該突變基因的新生兒禁止使用氨基糖苷類藥物。

一個耳聾患者會耗費大量的社會資源,大多數(shù)聽力缺陷兒童來自聽力正常家庭,由于聽力篩查具有太多局限性,結合耳聾易感基因篩查可以提早干預,避免“一巴掌致聾”和“一針致聾”的悲劇發(fā)生。