陳智偉 孫艷 代丹嬌 張華清

(南方科技大學(xué)醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣東 深圳 518000)

骨質(zhì)疏松癥(OP)是以骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞、脆性增加和骨折風(fēng)險(xiǎn)為特征的一種全身性疾病[1]。其具有潛在的破壞性后果和較高的累積骨折發(fā)生率,對(duì)公共衛(wèi)生造成重大的挑戰(zhàn)。與年齡相關(guān)的OP中,干細(xì)胞調(diào)節(jié)失衡可能是引起疾病發(fā)生的一項(xiàng)關(guān)鍵機(jī)制之一[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種廣泛存在于骨髓腔中的干細(xì)胞,具有向多種類型的骨細(xì)胞分化并分泌多種調(diào)節(jié)骨代謝物質(zhì)的多功能細(xì)胞的潛能[3]。諸多研究[4-5]表明,在機(jī)體病理狀態(tài)下,BMSCs的功能發(fā)生了變化失調(diào),導(dǎo)致骨代謝失衡,最終導(dǎo)致OP的發(fā)生。研究[6]報(bào)道,腸道微生物區(qū)系通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)(如破骨細(xì)胞發(fā)生)、腸道鈣吸收、神經(jīng)遞質(zhì)(如5-羥色胺)釋放等來調(diào)節(jié)骨量。因此,明確腸道微生物具體調(diào)節(jié)機(jī)制有助于尋找新的生物標(biāo)志物,掌握其與骨量紊亂的關(guān)系。三甲胺-N-氧化物(TMAO)是一種腸道微生物依賴的膳食膽堿代謝產(chǎn)物,已被證明與心血管風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[7]。最近的一項(xiàng)研究[8]發(fā)現(xiàn),TMAO與年齡相關(guān)性O(shè)P密切相關(guān)。然而,關(guān)于TMAO如何影響骨代謝以及潛在的分子機(jī)制的研究較少。本研究旨在探討TMAO對(duì)BMSCs功能的影響,以明確TMAO在OP發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年1月在我院住院期間行骨密度檢查的老年OP患者20例。納入標(biāo)準(zhǔn)[9]:股骨頸骨密度T評(píng)分<-2.5SD;年齡<70歲;自愿參與本項(xiàng)研究;無其他基礎(chǔ)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)[10]:年齡≥70歲;存在其他基礎(chǔ)疾病。將20例OP患者納入研究組,選取相同年齡層的20例健康志愿者為對(duì)照組。所有病人均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(LCYJ2021083)。

1.2方法

1.2.1材料 TMAO(貨號(hào)317594,Sigma-Aldrich,Burlington,MA,USA)、胎牛血清(FBS)(貨號(hào)12483020,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)、α-改良Eagle培養(yǎng)基(α-MEM)(貨號(hào)SH302265.01,Hyclone,Logan,Utah,USA)、成脂分化培養(yǎng)基(貨號(hào)RASMX-90031,Cyagen,Guangzhou,China)、成骨分化培養(yǎng)基(貨號(hào)RASMX-90021,Cyagen,Guangzhou,China)、活性氧(ROS)檢測試劑盒(貨號(hào)KGT010-1,KeyGen Biotech,南京,中國)、人氧化三甲胺(TMAO)ELISA試劑盒(貨號(hào)JL47698,江萊生物,北京,中國)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自CUSABIO生物技術(shù)公司(中國武漢)?？够罨疊細(xì)胞核因子κB輕鏈增強(qiáng)子(NF-κB)-p65(Cat#ab16502)的抗體購自Abcam(Cambridge,MA,USA)?？惯^氧化物酶體增殖物激活受體y(PPARγ)(目錄號(hào)AF6284)和runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)(目錄號(hào)AF0313)的抗體獲自Affinity Biosciences(中國江蘇)。

1.2.2BMSCs的原代培養(yǎng)及特性研究 分離和擴(kuò)增大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)。采用頸椎脫位法處死的6周齡大鼠,將其浸泡在75%的乙醇5～10 min,使用無菌手術(shù)器械,仔細(xì)分離完整的大鼠脛骨和股骨。骨髓細(xì)胞在1.073 g/mL Percoll密度梯度中沖洗和離心。從界面收集富集的細(xì)胞,用在加添加10%胎牛血清和、1%青霉素-鏈霉素-新霉素的α-MEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后,丟棄未貼壁細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌貼壁細(xì)胞兩次。每隔3 d加入和更換新鮮的完整培養(yǎng)液,第3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞增殖試驗(yàn) 用不同劑量(0、50、100、200、400、600 μMmol/L)的TMAO三甲氧胺處理BV2細(xì)胞,觀察三甲氧胺對(duì)細(xì)胞活力的量效關(guān)系。用CCK8溶液在五個(gè)不同的時(shí)間段法評(píng)估細(xì)胞活力。使用微型平板閱讀器檢測450 nm處的吸光度,以便計(jì)算每個(gè)值并編繪制增殖曲線。

1.2.4活性氧測定 使用活性氧檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用不同濃度的氧化三甲胺處理48 h后,收集細(xì)胞,用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌兩次,再用二氯二氫熒光素二乙酸酯在37℃避光中孵育30 min。在用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次以完全去除任何未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA后,用FACSCantoTM II流式細(xì)胞儀檢測活性氧水平。

1.2.5成脂和成骨分化 將BMSCs接種于12孔板中,用含10-7mmol地塞米松、10 mmol β-甘油磷酸酯和50 μ mmol抗壞血酸-2-磷酸的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基或成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10-6mmol地塞米松、0.2m mmol吲哚美辛、0.1m mmol胰島素、1m mmol 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)處理。在第14天,通過茜素紅S或油紅O染色來評(píng)估分化能力。為了形成鈣沉積,細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌,并用70%乙醇固定15 min。細(xì)胞用0.5%茜素紅S(pH=4.1)室溫放置10 min,蒸餾水清洗3次。橙紅色染色顯示鈣沉積的位置和強(qiáng)度。光鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)鈣沉積情況。脂肪滴形成用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌,10%甲醛固定30 min。在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌兩次后,細(xì)胞在新鮮稀釋的油紅O溶液中染色1 h。然后,去除污漬,用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞兩次。用倒置顯微鏡觀察油紅O染色的細(xì)胞圖像。

1.2.6細(xì)胞培養(yǎng)上清液中促炎癥細(xì)胞因子濃度的檢測 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別加或不加TMAO處理12、24、48 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。促炎細(xì)胞因子(IL-1、β、IL-6、TNF-α)用ELISA試劑盒檢測。

1.2.7Western印跡分析 細(xì)胞刺激48 h后,采用放射免疫沉淀試驗(yàn)提取不同組蛋白,采用二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離總蛋白,并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜中。然后將膜在含有5%脫脂奶粉的三緩沖鹽水中封閉1 h,之后與抗PPARγ(1:500)、C/EBP-α(1:1 000)、RUNX2(1:1 000)、OPN(1:1 000)、NF-κB(1:1 000)和GAPDH(1:2 000)的一抗在4 ℃孵育過夜。然后用TBST洗滌膜,用二抗孵育1 h。使用Pierce ECL Western Blotting底物檢測抗體反應(yīng)條帶。使用Image J軟件分析條帶強(qiáng)度的定量。

2 結(jié) 果

2.1OP患者血清TMAO水平和正常人比較 TMAO濃度與骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)(R2=-0.518,P=0.019)(見圖1A)。與正常組比較,骨質(zhì)疏松癥組TMAO濃度明顯升高(P=0.007<0.01)(見圖1B)。

2.2TMAO對(duì)BMSCs增殖的影響 通過檢測OP患者血液樣本中TMAO水平的變化,我們選擇了合適的TMAO濃度進(jìn)行后續(xù)研究。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,結(jié)果表明,50和100 μM濃度的TMAO對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響,而200～600 μM濃度的TMAO則以時(shí)間和劑量依賴的方式顯著抑制細(xì)胞的生長(見圖2)。

注:A.OP患者和正常人血清TMAO水平與骨密度相關(guān)性;B.采用ELISA法檢測OP患者和正常人血清TMAO水平。圖1 OP患者血清TMAO水平變化

圖2 不同TMAO濃度對(duì)BMSCs增殖的影響

2.3TMAO對(duì)BMSCs釋放活性氧和促炎細(xì)胞因子水平的影響 TMAO處理后BMSCs中活性氧的形成增加,尤其是當(dāng)TMAO濃度在200～600 μM范圍內(nèi)時(shí)(圖3A、B)。根據(jù)這些結(jié)果,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇了TMAO的濃度為200 μM。為闡明TMAO對(duì)BMSCs促炎細(xì)胞因子水平的影響,采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TMAO對(duì)BMSCs促炎細(xì)胞因子水平的影響。結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,研究組IL-1β(P<0.001)、TNF-α(P<0.001)和IL-6(P<0.001)水平明顯升高(圖3C、D、E)。

注:(A)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;(B)用平均熒光百分率表示ROS水平的變化;(C、D、E)用ELISA法測定促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)水平。圖3 TMAO對(duì)BMSCs活性氧釋放和促炎細(xì)胞因子水平的影響

2.4TMAO對(duì)BMSCs的影響 為了闡明TMAO對(duì)BMSCs成脂分化和成骨分化的影響,我們?cè)诔芍T導(dǎo)培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別加入和不加TMAO處理BMSCs、油紅O染色觀察脂肪滴形成情況、茜素紅染色觀察鈣沉積情況,結(jié)果表明,TMAO處理的細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生更多的脂肪滴,同時(shí)礦化結(jié)節(jié)減少(圖4A,B放大倍數(shù)見圖)。通過Western印跡分析進(jìn)一步檢測相應(yīng)的成骨(Runx2和OPN)或成脂(PPAR、γ和C/EBP-α)標(biāo)志物的表達(dá),結(jié)果表明,TMAO可上調(diào)PPARγ和C/EBp-α蛋白的表達(dá),降低Runx2和OPN蛋白的表達(dá)(圖4C,D),提示TMAO對(duì)BMSCs成脂分化有促進(jìn)作用,但對(duì)成骨分化有抑制作用。

2.5TMAO通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)BMSCs功能 NF-κB信號(hào)通路已被證明在骨代謝的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。我們檢測NF-κB蛋白水平,以確定NF-κB信號(hào)通路是否參與了三甲氧胺誘導(dǎo)的BMSCs分化功能。結(jié)果表明:無論是單次注射還是單次注射TMAO,BMSCs中NF-κB蛋白的表達(dá)水平均在氧化三甲胺存在的情況下升高(圖4C,D)。為確定NF-κB活性是否參與TMAO調(diào)節(jié)的BMSCs功能,我們應(yīng)用NF-κB抑制劑BAY 11-7082阻斷NF-κB的活性,如圖5A和B所示,與TMAO處理組相比,BAY 11-7082處理組的活性氧水平顯著降低。同樣,ELISA結(jié)果顯示,BAY11-7082預(yù)處理可顯著降低TMAO誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平(圖5C、D、E)。此外,經(jīng)TMAO處理的BMSCs進(jìn)入OIM后,Bay11-7082處理組的Runx2蛋白表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)明顯增加(圖5F,G)。以上結(jié)果表明NF-κB活性在氧化三甲胺處理BMSCs的細(xì)胞功能中起著至關(guān)重要的作用(圖5H)。

3 討 論

OP的特征是骨量和/或骨質(zhì)的減少導(dǎo)致骨骼脆性增強(qiáng)。骨強(qiáng)度不能在體內(nèi)直接測量,但骨密度與骨強(qiáng)度高度相關(guān)。因此,骨密度值經(jīng)常被用作預(yù)測骨折風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵臨床指標(biāo)。在本研究中,TMAO水平與骨密度值呈顯著負(fù)相關(guān),OP患者血清TMAO水平高于對(duì)照組,提示TMAO在OP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

最近的研究[11-13]表明,腸道微生物可能是骨生理學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。腸道微生物區(qū)系可以通過細(xì)菌修飾或通過它們的代謝物的作用來激活包括骨髓在內(nèi)的各種組織中的炎癥反應(yīng)。TMAO是一種腸道微生物依賴的膳食膽堿代謝產(chǎn)物,已被證明與OP相關(guān)。在本研究中,BMSCs經(jīng)三甲氧胺處理后,細(xì)胞增殖明顯下降,而促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)水平明顯升高。此外,TMAO處理的BMSCs內(nèi)活性氧的產(chǎn)生呈劑量依賴性增加。提示TMAO對(duì)BMSCs功能的影響可能是通過激活炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。目前,OP被廣泛認(rèn)為是由BMSCs代謝異常引起的疾病。許多證據(jù)表明[14-15],OP的BMSCs在內(nèi)在信號(hào)上存在缺陷,導(dǎo)致功能改變,導(dǎo)致成骨分化能力低下,有利于增加脂肪生成。本研究發(fā)現(xiàn)TMAO對(duì)BMSCs成脂分化有誘導(dǎo)和促進(jìn)作用,但對(duì)BMSCs成骨分化有抑制作用。成脂分化標(biāo)志蛋白PPARγ和C/EBp-α表達(dá)上調(diào),成骨分化蛋白R(shí)unx2和OPN表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果證實(shí)了TMAO通過調(diào)節(jié)BMSCs的分化參與了OP的發(fā)生發(fā)展。

NF-κB是炎癥和骨重建過程的主要調(diào)節(jié)者。NF-κB活性的增加伴隨著骨吸收的增強(qiáng)和骨形成能力的降低[15]。本研究顯示TMAO處理后NF-κB p65表達(dá)增加。為確定NF-κB的調(diào)節(jié)是否與TMAO介導(dǎo)的BMSCs功能有關(guān),用NF-κB的特異性抑制劑BAY 11-7082預(yù)處理細(xì)胞2 h,然后用TMAO處理。結(jié)果表明,NF-κB抑制劑BAY11-7082能顯著降低BMSCs促炎細(xì)胞因子(IL-1β、α和IL-6)的產(chǎn)生和活性氧的釋放,與TMAO治療組相比(P<0.05)。此外,Bay11-7082可顯著逆轉(zhuǎn)Runx2(P<0.05)和鈣結(jié)節(jié)的表達(dá)。然而,這項(xiàng)研究有幾個(gè)局限性。首先,樣本量相對(duì)較小,需要更大的樣本量才能擴(kuò)大研究范圍。其次,盡管本研究證實(shí)TMAO通過NFκB信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨BMSCs的功能(包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)),但也可能涉及其他信號(hào)通路(如自噬信號(hào)通路),這需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。最后,TMAO對(duì)BMSCs成骨分化的抑制作用還有待體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,TMAO水平與骨密度值呈顯著負(fù)相關(guān)。TMAO通過上調(diào)NF-κB信號(hào)通路抑制BMSCs增殖,增加促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和活性氧的釋放,抑制成骨分化,促進(jìn)成脂分化,可能導(dǎo)致骨代謝失衡,加重骨丟失,進(jìn)而導(dǎo)致OP的發(fā)生。(圖4、圖5見封三)。